复旦生化-课件核酸化学

核酸化学

BiochemistryofNucleicAcids研究历史核酸化学研究史（1）1869年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名“核质(Nuclein)

”。1879年Kossel经过10年的努力,搞清楚了核质中有四种不同的组成部分:A,T,C和G。核酸化学研究史（2）1889年Altman建议将”核质”改名为“核酸”,认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。1909年Levene发现酵母的核酸含有核糖1930年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖－脱氧核糖,得出了一个概念:植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸－核糖(碱基)－磷酸"的骨架结构,解决了DNA分子的线性问题,还在1935年提出"四核苷酸",认为这四种碱基的含量是一样的。核酸化学研究史（3）1950年

Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分,得知[A]=[T],[G]=[C],[A+G]=[C+T]1953年Watson,Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果,提出了DNA的双螺旋模型(Doublehelix)。几星期后提出了半保留式复制模型。1957年Meselsnhe&Stahl用密度梯度超离心法和同位素标记-半保留复制假说。核酸化学研究史（4）1958年

Kornberg得到高纯度的DNApolymerase,这种酶需要一个模板DNA。1960年Cairns拍下了复制中的细菌DNA的电镜照片。

1970年发现第一个DNA限制性内切酶。1972年DNA重组技术的建立。1978年双脱氧DNA测序法的建立。1990年人类基因组(HGP)计划实施。核酸化学研究史-rRNA（5）早在上世纪30年代后期就发现细胞质和细胞核中都有核酸存在，但用1924年福尔根发明的染色法去染色，只能使细胞核中的核酸染色。但两种核酸在260nm的吸收非常相似。1941年，细胞学家J.Brachet和T.Caspersor注意到细胞质中的核酸与蛋白质的合成有密切的关系。50年代，通过电子显微镜和物理化学手段发现大肠杆菌细胞质的RNA常常存在于蛋白质合成相关的颗粒中（Ф20nm,用35S进行脉冲式标记的实验证明该颗粒是蛋白质合成的所在地），简称核糖体。核糖体得到分离后，发现里面含RNA-rRNA。Watson等发现rRNA的G≠C，A≠U，断定是一单链分子。核酸化学研究史-mRNA

（6）1948年有人报道，当噬菌体感染了细菌后会产生一种很不稳定的RNA，而大多数是和核糖体结合在一起。Brenner,Jacob等人用13C，15N标记蛋白质，用32P标记核酸的方法证实了这是一种新的RNA分子，命名为信使RNA,即mRNA(m,messenger)。1961年，Spielman创造了分子杂交法，通过32P

-mRNA-DNA杂交分子证明了mRNA的存在。核酸化学研究史-tRNA（7）

1957年Hoagland,M.B.发现一类稳定的RNA小分子，不与核糖体结合，因而不同于mRNA和rRNA。Crick,F.比较了核酸和氨基酸的大小和形状后，认为不可能在空间上互补，因此他对核酸→蛋白质的信息传递作了以下预测：a).它是一种分子转换器，使信息从核酸序列转换成氨基酸序列；b).这种分子很可能是核酸；c).它不论以何种方式进入蛋白质翻译系统的模板，都必须与模板形成氢键（即配对）；d).有20种分子转换器，每种氨基酸一个；e).每种氨基酸必定还有一个对应的酶，催化与特定的分子转换器结合。

1963年，Ehrenstein等人用实验证明了Hoagland发现的分子就是Crick预言的分子转换器，即tRNA。1965年Holley经过7年努力测出酵母Ala-tRNA序列。核酸化学研究史-遗传密码的破译（8）1953年Dounce假设DNA通过RNA将信息传给蛋白质，RNA上每三个核苷酸形成一个“空洞”，正好将一个个氨基酸装进去。该假说允许三联体的重叠。命中率80％1954年物理学家Gamow与Teller等人联手，也提出三联体学说，并指出不可重复的特点。

命中率20％1957年

Crick也提出了三联体的假说。他意识到要解决“天书”的“词法”和“句法”，必须要有一本标准词典，以便决定64种组合中的44种是无用的。

即“简并密码”和“阅读框”1961年

Crick在Bencer,S的突变实验的基础上，用重组法得到了+++和---型，发现读框和野生型一致，从而证明了三联体的假说。1961年

Nirenberg,Matthaei&Ochoa用生物化学手段开始了密码测试，得到20种氨基酸的密码子的核酸成份。1964年Khorana合成了U和G交替的多聚核苷酸，所对应的合成肽为VCVCVC，对照密码子的核酸成份可以最终决定。后来合成了UUGUUUGUUG…产生了poly(L),poly(C)和poly(V)。1964年

Nirenberg找到了更妙的突破口，合成三联体，它能与tNRA进行密码子－反密码子的碱基配对，从而影响肽链的合成。1966年遗传密码的破译工作基本结束，Crick绘制了密码表，提出了摆动学说（wobbleconcept)，及时收回了“同义词”不存在的假设。

JamesWatson(left)andFrancisCrickFrancisHarryComptonCrick

JamesDeweyWatson

MauriceHughFrederickWilkins

X-raydiffractionphotosofDNAGreatBritainUSAGreatBritainInstituteofMolecularBiology

Cambridge,GreatBritainHarvardUniversity

Cambridge,MA,USAUniversityofLondon

London,GreatBritain1916-1928-1916-2004"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962RobertW.Holley

HarGobindKhorana

MarshallW.Nirenberg

USAUSAUSACornellUniversity

Ithaca,NY,USAUniversityofWisconsin

Madison,WI,USANationalInstitutesofHealth

Bethesda,MD,USA1922-19931922-1927-TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1968"fortheirinterpretationofthegeneticcodeanditsfunctioninproteinsynthesis"

青山衬托之下，是一片金灿灿的中国水稻梯田。2002年4月5日以中国梯田为封面的«Science»杂志以14页篇幅率先发表了一个重大成果—中国人独立完成的论文《水稻（籼稻）基因组的工作框架序列》，显示对中国科学家成就充分肯定。COVERPhotographoftheHongheHaniriceterracesinYunnanProvince,China.Inthisissue,twoseparateresearchgroupsreportdraftsequencesoftwostrainsofrice--japonicaandindica.Inaddition,theEditorial,NewsFocus,Letters,andPerspectiveshighlightthesignificanceofthericegenometotheworld'spopulation.[Image:LiwenMaandBaoxingQiu,BeijingGenomicsInstitute]核糖核酸（RNA）：细胞质，参与蛋白质的生物合成

mRNA（信使RNA），5%，Pr合成的直接模板

tRNA（转运RNA），15%，活化与转运AArRNA（核糖体RNA），80%，充当装配机，提供场所。脱氧核糖核酸（DNA）：核内染色质，遗传的物质基础

基因

—DNA分子中的

功能片段

（决定遗传特性）（特定的碱基序列）

核酸的分类、分布与功能核酸的分子组成核酸的元素组成：C、H、O、N、P组成核酸的基本单位—核苷酸

多核苷酸核苷酸磷酸核苷（A、G）（U、C、T）戊糖碱基嘌呤碱嘧啶碱核酸A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）U（尿嘧啶）、C（胞嘧啶）、T（胸腺嘧啶）两类核酸的分子组成RNADNA组分磷酸磷酸戊糖核糖脱氧核糖碱基嘌呤嘧啶AGUCT核酸骨架结构DNA的水解产物中有碱基、磷酸、脱氧核糖、核苷、核苷酸等，因而推测DNA的骨架结构为DNA的骨架结构RNA分子与DNA分子的区别只在一个羟基，TvsU，但就这点区别，RNA分子的化学性质比DNA活泼得多。RNA的骨架结构碱基结构

BaseStructure嘌呤腺嘌呤（A）（6-氨基嘌呤）鸟嘌呤（G）（2-氨基-6-氧嘌呤）PurinesPyrimidines嘧啶胞嘧啶（C）（2-氧4-氨基嘧啶）尿嘧啶（U）（2，4-二氧嘧啶）胸腺嘧啶（T）（5-甲基尿嘧啶）

胞嘧啶中

尿嘧啶及胸腺嘧啶中能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性-主要是环内氨基的贡献鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上核苷和核苷酸NucleosidesandNucleotides核苷=碱基+戊糖（nucleoside,Ns)糖苷键，嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1与糖的C-1’以N-S糖苷键相连。腺嘌呤核苷（腺苷）胞嘧啶脱氧核苷（脱氧胞苷）核苷酸=核苷+磷酸（nucleotide,Nt)连接方式：磷酸酯键，糖环上所有游离羟基（核糖的C-2、C-3、C-5及脱氧核糖的C-3、C-5）均能与磷酸发生酯化结合。生物体内多数核苷酸是5-核苷酸，即糖环上的C-5与磷酸酯化。腺嘌呤核苷酸（腺苷酸）脱氧胞嘧啶核苷酸（脱氧胞苷酸）名称与缩写(1)RNA：ribonucleic

acid核糖核酸DNA：deoxyribonucleic

acid脱氧核糖核酸pyrimidine：cytosine(Cyt)胞嘧啶

嘧啶thymine(Thy)胸腺嘧啶

uracil(Ura)尿嘧啶purine：adenine(Ade)腺嘌呤

嘌呤

guanine(Gua)鸟嘌呤

名称与缩写(2)Ribonucleoside(Ns)核糖核苷（不带磷酸）adenosine(Ado)腺(嘌呤核)苷guanosine(Guo)鸟(嘌呤核)苷cytidine(Cyd)胞(嘧啶核)苷

thymidine(Thd)胸(腺嘧啶脱氧核)苷uridine(Urd)尿(嘧啶核)苷Ribonucleotide(Nt)核糖核苷酸（带磷酸）adenosine5’-mono(di,tri)phosphaste；

AMP,ADP,ATPdeoxyribonucleoside脱氧核糖核苷（不带磷酸）deoxyadenosine(dAdo)……deoxyribonucleotide脱氧核糖核苷酸（带磷酸）

dAMP,dADP,dATP……dNTPDNA中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤TCAG－CH3Ura与DNA分子中的Thy的区别RNA分子中的四个碱基2、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离3.核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性DNA等电点为4-4.5RNA等电点为2-2.5碱基、核苷、核苷酸的ｐＫ值碱基

adenine4.15,9.8cytosine4.5,12.2guanine3.2,9.6thymine9.9,>13核苷

adenosine3.5,12.5deoxyadenosine3.8cytidine4.15,12.5deoxycytidine4.3,>13guanosine1.6,9.2deoxyguanosine2.5uridine9.2,12.5deoxythymidine9.8,>13核苷酸AMP3.7,6.1:dAMP4.4ADP3.9,6.3:---------CMP4.5,6.3:dCMP4.6GMP2.4,6.1,9.4:dGMP2.9,9.7UMP6.4,9.5:dTMP10.0核酸的紫外吸收碱基含有共轭双键最大吸收峰260nm左右核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。ε：摩尔吸光系数A：吸收值W：每升溶液磷重量L：比色杯内径OD260的应用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0含杂蛋白及苯酚，降低3.判断DNA是否变性由于共振作用，所有核苷酸的碱基都吸收紫外光，核酸在260nm附近有强大光吸收。修饰碱基（核苷）AllofthefourbasesintRNAcanbemodified与氨基酸一样，碱基在细胞中也受到各种各样的修饰，其产物常常扮演信号传导信使分子、营养因子、辅酶等角色，并对核酸结构的稳定性起着重要作用胸腺嘧啶核糖核苷二氢尿苷假尿苷4-硫尿苷3-甲基胞苷次黄苷，肌苷喹啉7-甲基鸟苷W(Y）核苷体内某些重要核苷酸能量物质：ATP等；酶辅助因子：NAD+、NADP+和FAD等；信号传导：环腺苷酸（cAMP），环鸟苷酸（cGMP）;重要代谢中间物：PAPS（3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸）、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）、UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）、UDPGA（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸）、CDP-胆碱（乙醇胺）等AMPADPATP3,5-cAMP核酸的物理性质I1、性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，粘度DNA大于RNA。核酸变性后，粘度下降。核酸的物理性质II3、溶解性：RNA和DNA都是极性化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L的NaCl溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl中溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。酸或碱水解核酸的水解RNA的碱水解 DNA和RNA的共价主链可以被非酶条件缓慢水解磷酸二酯键，试管中RNA可被碱性条件迅速水解，而DNA则不。RNA的C-2’羟基直接参与了水解过程，2’,3’-单磷酸是碱对RNA作用的第一个产物，后者进一步迅速被水解生成2’-及3’-核苷单磷酸。碱性条件下RNA的水解(Palindrome)粘性末端末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为粘性末端。这种酶在基因工程中应用最多。平头末端在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口.双螺旋的基础Watson,CrickandtheirdoublehelixmodelJamesDeweyWatson,1928-FrancisHarryComptonCrick,1916-

1953年2月28日，他们发现了DNA双螺旋Braggs,Wilkins,Franklinand#51photoMauriceHughFrederickWilkins,1916-RosalindFranklin(1920-1958)SirJohnRandall第51号照片，摄于1952年底A型DNAB型DNA核酸中核苷酸相继以磷酸二酯键共价连接，一个核苷酸的5’羟基与另一个核苷酸的3’羟基形成磷酸二酯键。核酸的共价主链由磷酸及戊糖残基构成，含氮碱基可以看成是连接到主链上固定间隔的侧链基团。DNA和RNA的骨架结构是亲水的，糖残基的羟基与水形成氢键，磷酸基团的pKa接近于零，pH7时完全离子化并带负电，所带负电荷通常与带正电的蛋白质、金属离子及多胺发生离子作用被中和。pA-C-G-T-AOHpApCpGpTpApACGTAWatson和Crick定义的核酸中碱基对的氢键模式DNA中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤TCAG碱基间的氢键可以有不同形式Watson-CrickHoogsteen碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式；碱基中的