成人幽门螺杆菌对胃癌细胞侵袭能力的影响,肿瘤学论文

成人幽门螺杆菌对胃癌细胞侵袭能力的影响,肿瘤学论文摘要：目的讨论幽门螺杆菌(H.pylori)感染与胃癌细胞侵袭转移的关系及可能机制。方式方法将幽门螺杆菌与胃癌细胞株SGC7901共培养12h;按胃癌细胞与H.pylori菌落之比为1∶100，与SGC7901共培养0、12、24h来进行Western-blot实验，测定基质金属蛋白酶9(MMP-9)、细胞外总调节蛋白激酶1/2(t-ERK1/2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)在胃癌细胞中表示出水平的变化;共培养24h后，分为两组，不处理组和参加ERK抑制剂U0126的处理组，应用Transwell小室细胞侵袭实验，比拟抑制ERK前后对胃癌细胞运动、侵袭能力的影响。结果随着胃癌细胞与H.pylori比例增大，胃癌细胞中MMP-9、p-ERK1/2表示出明显增高(P0.01),t-ERK1/2表示出水平无明显差异(P0.05)。不处理组胃癌细胞穿透基膜的数量与H.pylori比例呈正相关，而U0126处理组的胃癌细胞穿透基膜数量明显减少。各组之间的差异有统计学意义(P0.01)。结论幽门螺杆菌感染能促进胃癌细胞的侵袭迁移能力，可能与其通过ERK信号途径加强MMP-9表示出而诱导胃癌的发生发展有关。本文关键词语：幽门螺杆菌;胃肿瘤;MMP-9;ERK1/2;侵袭转移;Abstract：ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetweenhelicobacterpyloriinfectionandinvasionandmetastasisofgastriccancercellsanditspossiblemechanism.MethodsHelicobacterpyloriandgastriccancercelllineSGC7901werecoculturedfor12h;accordingtogastriccancercellsandh.pyloricoloniesTheratiowas1∶100,co-culturedwithSGC7901for0h,12h,and24h.Theexpressionsofmatrixmetalloproteinase-9(MMP-9),extracellulartotalregulatoryproteinkinase1/2(t-ERK1/2),andphosphorylationofextracellularregulatedproteinkinase1/2(p-ERK1/2)ingastriccancercellswereassessedbyWestern-blot.After24hoursofco-culture,theabilityofinvasionandmetastasisofgastriccancercellswereevaluatedbyusingTranswellchambersattachedwithpolycarbonatefiltersandreconstitutedbasementmembrane.TheassaywasusedtodividetheuntreatedgroupandtheERKinhibitorU0126treatmentgrouptocomparetheeffectsofinhibitingERKonthemovementandinvasionofgastriccancercells.ResultsWiththeincreaseoftheratioofgastriccancercellstoH.pylori,theexpressionofMMP-9andp-ERK1/2ingastriccancercellswassignificantlyincreased(P0.01),t-ERK1/2hadnosignificantdifference(P0.05).ThenumberofgastriccancercellsintheuntreatedgrouppenetratedthebasementmembraneandtheratioofH.pyloriwaspositivelycorrelated,whilethenumberofgastriccancercellsintheU0126treatmentgroupwassignificantlyreduced.Thedifferencebetweenthe2groupswasstatisticallysignificant(P0.01).ConclusionHelicobacterpyloriinfectioncanpromotetheinvasionandmigrationofgastriccancercells,whichmayberelatedtoERKsignalingpathway.Keyword：Helicobacterpylori;Gastricneoplasms;MMP-9;ERK1/2;Invasionandmetastasis;当前，成人幽门螺杆菌(helicopterpylori,H.pylori)的感染率在世界范围内已超过50%，在我们国家幽门螺杆菌感染率更高层次达80%[1,2]。潘等[3]研究表示清楚，MMP-9的表示出能促进胃癌细胞的运动和侵袭能力，其与胃癌的预后相关。本研究拟采用不同浓度的H.pylori感染胃癌细胞，利用Western-blot实验来检测胃癌细胞中MMP-9、p-ERK1/2和t-ERK1/2表示出的变化水平，再进一步利用细胞侵袭实验，观察H.pylori对胃癌细胞侵袭能力的影响，来探究H.pylori与胃癌细胞侵袭转移能力改变的分子机制，为胃癌中根治H.pylori提供一定的理论根据。1、材料与方式方法1.1、材料胃癌细胞株SGC7901购自于上海柯雷生物科技有限公司;幽门螺杆菌26695菌株(ATCC26695国际标准株)购自于美国ATCC;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司;HamsF12和RP-MI1640培养基购自美国Hyclone公司;链青霉素购自北京索莱宝科技有限公司，基质胶购自于美国BD生物科技有限公司，MMP-9抗体购自美国Abcam公司，ERK/p-ERK抗体购自美国CellSignalingTechnology公司，GADPH购自于美国SigmaAldrich公司，24孔Transwell室购自于美国Corning公司。1.2、方式方法1.2.1、细胞及细菌共培养使用HamsF12培养基，于37℃，5%CO2浓度的培养箱内培养，培养2～3天后传代。幽门螺杆菌26695国际标准株种植于含5%无菌脱纤维羊血、且经过高压灭菌的哥伦比亚琼脂培养基，于微需氧培养罐中，使用微需氧产气袋，置于37℃培养箱中进行培养。培养基经高压灭菌后自然冷却至50℃时添加脱纤维羊血及多粘菌素B(250U/L)，万古霉素(6mg/l)，两性霉素(2mg/l),TMP(5mg/l)，混匀后浇板。将长成菌落的H.pylori悬浮于含3%胎牛血清的HamsF12培养基中，测定OD660值，1OD660=1108菌落构成单位(CFU)。按胃癌细胞与幽门螺杆菌菌落之比为1∶0、1∶50、1∶100共培养12h;按胃癌细胞与幽门螺杆菌菌落之比为1∶100，与SGC7901共培养0、12、24h。再用PBS清洗5次，收集细胞并提取蛋白。1.2.2、Western-blot使用RIPA裂解液将待测蛋白调整至一样浓度待用。将等量蛋白参加到10%浓度SDS胶上样孔中，电泳120min后用半干转移法恒流转移，60min后将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。用含5%BSA的TBST室温封闭1.5h，再根据分子量剪下膜与抗MMP-9及GADPH抗体进行孵育，4℃过夜。一抗孵育结束后TBST洗3次，每次10min。接着在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h，孵育结束后TBST洗3次，每次10min。去掉多余的TBST后在膜上滴加ECL发光液发光，于数码凝胶分析系统(天能)采集曝光数据，用ImageJ图形处理软件分析目的条带。1.2.3、Transwell侵袭实验不处理组按1∶8比例用无血清HamsF12培养基稀释基质胶，混匀后汲取100l添加到Transwell小室中，37℃温箱成胶1h后取出，于下室添加500l含10%胎牛血清的F12培养基，上室参加无血清F12培养基重悬的SGC7901细胞，放入37℃培养箱内。36h后取出。无菌棉签拭去小室上层的细胞，2%多聚甲醛固定小室下层5min。PBS清洗后苏木精染色5min，再次PBS清洗。高倍镜下随机选取5个视野计数。处理组参加无血清HamsF12培养基稀释基质胶时，再参加ERK抑制剂U0126，孵育4h后，其余步骤同不处理组。1.3、统计分析应用SPSS13.0软件采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2、结果2.1、幽门螺杆菌对胃癌细胞中MMP-9表示出的影响与h.pylori共培养24h之后，胃癌细胞中MMP-9的表示出量随胃癌细胞与h.pylori菌数比例的增加而增加(图1)。图1MMP-9在SGC7901中表示出情况2.2、H.pylori对胃癌细胞p-Erk1/2、t-Erk1/2表示出的影响如此图2所示，与h.pylori共培养之后胃癌细胞中p-Erk1/2的表示出量也随胃癌细胞与h.pylori比例的增加而增加，而t-Erk1/2的表示出变化不明显。图2p-Erk1/2、t-Erk1/2在SGC7901中表示出情况2.3、Transwell侵袭实验结果不处理组中，随着胃癌细胞与H.pylori比例的增加，穿透基膜的胃癌细胞数目增加，各组穿透基底膜的细胞数之间差异有统计学意义(P0.01)，而参加ERK抑制剂U1206的处理组中，穿透基膜的细胞数明显减少，各组之间的差异有统计学意义(P0.01)，见图3。图3胃癌细胞侵袭情况3、讨论H.pylori感染与人体慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤等疾病的发生、发展密切相关[4]。幽口螺杆茵作为细菌性致癌物，是胃癌最主要的致癌因素之一，但其潜在的致癌机制还尚不完全清楚。胃癌是起源于胃黏膜上皮的消化道恶性肿瘤，在我们国家胃癌的发病率占恶性肿瘤的第四位，死亡率占恶性肿瘤的第二位[5]，而死亡率高的主要原因又与胃癌的复发和转移有关。侵袭与转移是恶性肿瘤最主要的生物学特征，也是胃癌患者复发及死亡的主要原因[6]。肿瘤细胞侵袭转移是1个多因素、多步骤的复杂生物学经过，肿瘤细胞依靠内皮靶点和基底膜进行继发性侵袭[7]。当前的文献[8]表示清楚MMPs可参与肿瘤的产生、侵袭、转移调控机制，华而不实MMP-9是MMPs中降解基底膜主要成分Ⅳ型胶原蛋白最主要的酶，它还可通过毁坏局部组织构造促进肿瘤生长和肿瘤新血管构成而促进肿瘤转移。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌等[9,10,11]中，MMP-9的过表示出与肿瘤侵袭转移呈正相关。为了探究H.pylori能否是通过MMP-9而促进胃癌细胞的侵袭转移能力，本研究中，把胃癌细胞和H.pylori按1∶0、1∶50、1∶100的比例共同培养，Western-blot实验结果显示，MMP-9的表示出量增加了。讲明h.pylori可能是通过影响胃癌细胞中MMP-9的表示出，而加强肿瘤细胞的侵袭转移能力。同时，在肿瘤侵袭转移经过中，信号转导通路的作用也至关重要[7]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，是连接细胞外与细胞核之间信号转导的重要通路，其磷酸化形式激活后共同介入体内多种生理或病理经过的调节经过。华而不实，细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)是MAPKs家族中的一个亚族，磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)是ERK1/2磷酸化后的活性形式，通过从胞浆向胞核传递信号，介入细胞增殖分化等调节作用[12]。有文献[13]报道，在肺癌中激活ERK1/2，能使肿瘤细胞体外侵袭转移能力加强。ERK1/2的活化异常与肿瘤发生、发展经过有关[14]。而ERK1/2信号通路将通过磷酸化激活转录因子如激活蛋白1(AP-1),Elk-1等，华而不实AP-1位于基质金属蛋白酶家族(MMPs)基因启动子区域，持续的ERK1/2通路活化将上调MMPs表示出，导致重要的蛋白水解酶MMP-2等含量增加，使细胞外基质蛋白的分解加强而导致肿瘤侵袭、迁移的发生[15,16]。因而，ERK1/2及MMPs是肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键环节[17]。为了探究H.pylori促进胃癌细胞的侵袭转移能力的机制能否是通过ERK1/2通路，Western-blot实验结果显示，磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶1/2(pERK1/2)随着H.pylori比例的增加而显着增加。为了进一步研究，我们进行了Transwell侵袭实验，不处理组是不同比例H.pylori感染的胃癌细胞，处理组是参加ERK抑制剂剂U0126的不同比例H.pylori感染的胃癌细胞，分别测定各组细胞的侵袭力。结果表示清楚，未处理组的细胞穿透基膜的数目随着H.pylori比例的增加而增加。而处理组的细胞穿透基膜的数目却明显减少了，各组穿透基膜的数目差异具有统计学意义(P0.01)，提示H.pylori感染可能通过ERK1/2-MMP-9信号通路发挥作用，进而加强胃癌细胞侵袭能力。综上所述，H.pylori感染和胃癌发生、发展密切相关。华而不实幽门螺杆菌感染可通过激活ERK1/2信号通路，促进MMP-9的表示出，进而在胃癌侵袭和转移经过中发挥重要作用，此发现可有助于在胃癌的临床诊疗经过中找到可靠有效的治疗靶点。本研究中初步揭示了H.pylori可通过ERK1/2-MMP-9信号通路，调控胃癌的侵袭转移，为胃癌的治疗提供了新思路。以下为参考文献[1]ZhangRG,DuanGC,FanQT.Roleofhelicobacterpyloriinfectioninpathogenesisofgastriccarcinoma〔J〕．WorldJGastrointestPathophysiol,2021,7(1):97-107.[2]KhatoonJ,RaiRP,PrasadKN,etal.Roleofhelicobacterpyloriingastriccancer:Updates〔J〕．WorldJGastrointestOncol,2021,8(2):147-158.[3]PanG,ZhangX,RenJ,etal.Semaphorin5A,anaxonguidancemolecule,enhancestheinvasionandmetastasisofhumangastriccancerthroughactivationofMMP9〔J〕．PatholOncolRes,2020,19(1):11-18.[4]Rong-GuangZhang,Guang-CaiDuan,Qing-TangFan,etal.Roleofhelicobacterpyloriinfectioninpathogenesisofgastriccarcinoma〔J〕．WorldJGastrointestPathophysiol,2021,7(1):97-107.[5]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.Cancerstatisticsinchina,2021〔J〕．CACancerJClin,2021,66(2):115-132.[6]vanMarionDM,DomanskaUM,Timmer-BosschaH,etal.Studyingcancermetastasis:Existingmodels,challengesandfutureperspectives〔J〕．CritRevOncolHematol,2021,97:107-117.[7]JiangC,LiX,ZhaoH,etal.Longnon-codingRNAs:potentialnewbiomarkersforpredictingtumorinvasionandmetastasis〔J〕．MolCancer,2021,15(1):62.[8]ShayG,LynchCC,FingletonB.Movingtargets:EmergingrolesforMMPsincancerprogressionandmetastasis〔J〕．MatrixBiol,2021,46(3):200-206.[9]SchveigertD,CicenasS,BruzasS,etal.ThevalueofMMP-9forbreastandnon-smallcelllungcancerpatientssurvival〔J〕．AdvMedSci,2020,58(1):73-82.[10]LiLN,ZhouX,GuY,etal.PrognosticvalueofMMP-9inovariancancer:ameta-analysis〔J〕．AsianPacJCancerPrev,2020,14(7):4107-4113.[11]PanG,ZhuZ,huangJ,etal.Semaphorin5APromotesGastricCancerInvasion/MetastasisviaUrokinase-TypePlasminogenActivator/Phosphoinositide3-Kinase/ProteinKinaseB〔J〕．DigDisRes,2020,58(8):2197-2204.[12]McCubreyJA,SteelmanLS,ChappellWH,etal.RolesoftheRaf/MEK/ERKpathwayincellgrowth,malignanttransformationanddrugresistance〔J〕．BiochimBiophysActa,2007,1773(8):1263-1284.[13]ChenYY,LiuFC,ChouPY,etal.EthanolextractsoffruitingbodiesofAntro