胆汁酸稳态调节的选择性剪接研究,人体生理学论文

胆汁酸稳态调节的选择性剪接研究,人体生理学论文一、胆汁酸的合成与转运胆汁酸是胆固醇代谢的主要产物，胆汁的主要成分，调节多个生物经过，包括刺激肝脏胆汁分泌和促进小肠吸收脂肪及脂溶性维生素。胆汁酸可以通过激活特异性的受体和信号通路调节甘油三酯、胆固醇和葡萄糖的稳态平衡。肝脏是合成胆汁酸的唯一器官。90%~95%的胆汁酸直接由肝细胞内的胆固醇代谢产生。合成途径包括胆固醇7-羟化酶〔cholesterol7alpha-hydroxylase,CYP7A1〕介导的经典途径和类固醇27羟化酶〔sterol27-hydroxylase,CYP27A1〕介导的替代途径两种。肠道内的胆汁酸仅5%由粪便排出，95%在回肠末端被重吸收入血进行肠-肝循环。华而不实结合胆汁酸的重吸收与转运经过由两个转运蛋白超家族协同完成〔图1,表1〕:溶质载体〔solutecarrier,SLC〕超家族介导入细胞经过，不消耗ATP;ATP结合盒〔ATP-bingdingcassette,ABC〕转运体超家族介导出细胞经过，消耗ATP[1].牛磺酸/甘氨酸结合胆汁酸〔taurineandglycinconjugatedbileacids,T/G-BA〕,在回肠的重吸收主要由顶侧膜的顶膜钠依靠性胆汁酸转运体〔apicalsodiumdependentbileacidtransporter,ASBT〕〔SLC10A2〕和基底膜的有机溶质转运体〔organicsolutetransporteralpha-beta,OST-OST〕〔SLC51A-SLC51B〕协同完成[2].而细胞内运输由回肠脂质结合蛋白〔ileallipidbindingpro-tein,ILBP〕与胆汁酸结合。胆汁酸随门静脉血流运回肝脏，经肝细胞窦状隙膜的钠-牛磺胆酸共转运多肽〔Na-taurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP〕〔SLC10A1〕进入肝细胞，再与新合成的结合胆汁酸一起由肝细胞胆小管膜的胆盐输出泵〔bilesaltex-portpump,BSEP〕〔ABCB11〕分泌入胆道系统。除了占大多数的T/G-BA,少量硫酸盐或葡萄糖醛酸结合胆汁酸〔sulfateandglucuronideconjuga-tedbileacid,S/U-BA〕由肠上皮细胞基底膜的多药耐药相关蛋白-3〔multidrugresistance-associatedpro-tein-3,MRP3〕〔ABCC3〕泵入门静脉系统，再由肝细胞胆小管膜的MRP2〔ABCC2〕分泌入胆道系统〔图1,表1〕.肠上皮细胞顶侧膜的MRP2将结合胆汁酸运回肠腔。少量羟基化胆汁酸〔hydroxylatedbileacid,H-BA〕由肝细胞胆小管膜的多药耐药蛋白-1〔multidrugresistanceprotein1,MDR1〕〔ABCB1〕分泌入胆道系统。游离胆汁酸在小肠各部和大肠通过弥散作用被动重吸收，由肝细胞窦状隙膜的有机阴离子转运蛋白1B1〔organicaniontransportprotein1B1,OATP1B1〕〔SLCO1B1〕和OATP1B3〔SLCO1B3〕摄入肝细胞[2].部分胆汁酸不经肝脏过滤进入体循环，但在肾脏经肾小球滤过后被近球小管的ASBT和OST-OST重吸收回体循环，尿液排出的胆汁酸量极少。胆汁淤积时肝细胞窦状隙膜的OST-OST、MRP3和MRP4〔ABCC4〕将各类结合及游离胆汁酸排入体循环，经尿液排出，具有一定的代偿意义。二、胆汁酸稳态的调节核受体〔nuclearreceptor,NR〕超家族成员法尼酯衍生物X受体〔farnesoidXreceptor,FXR〕〔NR1H4〕作为转录因子，广泛介入胆汁酸稳态各环节的调节〔表1〕.FXR通常与视黄醛衍生物X受体〔retinoidXreceptoralpha,RXR〕〔NR2B1〕构成异二聚体FXR/RXR，被激活后与靶基因启动子区FXR反响元件〔FXRresponseelement,FXRE〕结合，直接上调OST、OST、ILBP、BSEP、OATP1B1和OATP1B3等基因的转录[3,4].而FXR对CYP7A1、ASBT和NTCP等基因的转录具有抑制作用，主要由下面两条通路介导[3,5]:〔1〕FXR-SHP-LRH-1通路，华而不实小异二聚体伴侣〔smallhet-erodimerpartner,SHP〕〔NR0B2〕是FXR的直接靶基因，被诱导上调后，作为转录抑制因子与肝受体同系物-1〔liverreceptorhomolog-1,LRH-1〕〔NR5A2〕结合，抑制LRH-1的转录激活作用；〔2〕FXR-FGF15/19通路，成纤维细胞生长因子15/19〔fibro-blastgrowthfactor15,FGF15〈小鼠〉，FGF19〈人〉〕被FXR诱导上调后分泌入门静脉，随血流与肝细胞外表的FGF受体4〔FGFreceptor4,FGFR4〕结合，激活下游信号通路抑制靶基因转录。CYP7A1受FXR-SHP-LRH-1和FXR-FGF15/19两条通路的负反应抑制作用[3].而SHP、OST和OST〔Franken-berg等。2006〕均遭到FXR激活和抑制作用的动态调节[5,6].CYP7A1的转录也受肝X受体〔liverXre-ceptoralpha,LXR〕〔NR1H3〕的直接上调[5].胆固醇代谢合成胆汁酸的中间产物---氧化甾醇可激活LXR，对CYP7A1进行前馈调节；而胆汁酸可激活FXR,对CYP7A1进行负反应调节[5].有趣的是LXR/RXR与FXR/RXR均可直接上调OST、OST、ILBP及OATP1B1的表示出[4,5,7].三、选择性剪接的调节与功能真核生物的构造基因中含有具有表示出活性的外显子，还含有无表示出活性的内含子。转录时，外显子及内含子均转录到mRNA前体〔pre-mRNA〕,再通过剪接作用剪切掉内含子，连接外显子，得到成熟mRNA.而同一个pre-mRNA可通过不同的剪接方式产生不同的mRNA,称为选择性剪接〔或可变剪接〕.哺乳动物体内编码蛋白质的基因数目与线虫和拟南芥近似，与生物体和细胞的复杂性严重不符。而选择性剪接是增加真核生物多样性的重要机制之一。有研究认为94%的人类基因具有选择性剪接[8].剪接经过由剪接体〔spliceosome〕催化，它是由五个含有小核RNA〔smallnuclearRNA,snRNA〕的小核核糖核蛋白〔smallnuclearRibonucleoprotein,snRNP〕及其他非snRNP蛋白质组成的大分子核酸蛋白复合物。剪接体辨别内含子中的5剪接位点、3剪接位点及分支位点，完成内含子的切除和外显子的连接。剪接位点的辨别遭到多个顺式调控元件与反式调控因子的控制，顺式调控元件包括外显子剪接加强子〔exonsplicingenhancer,ESE〕、外显子剪接沉默子〔exonsplicingsilencer,ESS〕、内含子剪接加强子〔intronsplicingenhancer,ISE〕和内含子剪接沉默子〔intronsplicingsilencer,ISS〕.剪接调控因子主要包括富含丝氨酸〔serine,S〕和精氨酸〔ar-ginine,R〕构造域的SR蛋白〔SRprotein〕和核不均一核糖核蛋白〔heterogeneousnuclearRibonucleo-protein,hnRNP〕.SR蛋白主要与剪接加强子结合，提高相邻剪接位点的活性。hnRNP主要与剪接沉默子结合，抑制相邻剪接位点的活性。兴奋性与抑制性剪接调控因子的相对浓度、磷酸化状态、pre-mRNA的二级构造均会影响剪接位点的选择。而microRNA〔miRNA〕通过对剪接调控因子mRNA降解或翻译抑制，间接影响选择性剪接。由于RNA转录与剪接在空间和时间上严密偶联，转录延伸的速率〔即RNA聚合酶II的移动速率〕不同可影响强、弱剪接位点的辨别，延伸的速率减慢促进弱剪接位点的辨别，导致选择性外显子的纳入。染色质构型、核小体定位、组蛋白修饰和DNA甲基化可通过影响蛋白招募，或改变RNA聚合酶II的移动速率影响选择性剪接[18].由选择性剪接产生的转录变异体通常具有组织分布或发育阶段特异性。转录变异体的构造变化通常分为三类：〔1〕选择性剪接使mRNA产生提早终止密码子〔prematureterminationcodon,PTC〕,引起无意义介导的降解〔nonsense-mediateddecay,NMD〕,为真核生物控制mRNA质量的重要措施；〔2〕5或3非翻译区的改变，影响mRNA的稳定性或翻译，甚至第一外显子的改变伴有启动子改变，产生不同的转录调节形式；〔3〕蛋白构造改变，影响蛋白的亚细胞定位与功能[19].选择性剪接改变蛋白构造详细包括：1〕通过改变定位信号、翻译后修饰序列或与其他蛋白的互相作用位点而改变蛋白的亚细胞定位。亚细胞定位的改变也常伴有功能改变，尤其是膜结合型受体，其分泌型剪接变异体分泌入血会显着抑制正常的信号传导。2〕改变细胞的生命进程，选择性外显子的纳入或跳过，引起剪接变异体促凋亡/抗凋亡、增殖/抗增殖特性转换，影响血管新生，与肿瘤发育密切相关。3〕对转录因子的影响，选择性剪接改变反式激活构造域可影响RNA聚合酶II的活化，删除DNA结合域则导致与靶基因启动子结合能力丧失，转录因子可能无活性，可以能取代正常转录因子而产生显性失活作用。4〕影响酶的底物特异性或活性，通常使酶活性降低或丧失，但某些激酶的本身抑制作用被选择性剪接改变，也会产生组成性活化的激酶。5〕影响离子通道的开放时间、开放电压、离子特异性及对配体的反响性等各个方面[19].四、胆汁酸稳态调节的选择性剪接〔一〕FXR核受体FXR〔NR1H4〕有四种剪接变异体FXR1、FXR2、FXR1和FXR2.FXR和FXR具有不同的氨基端，而FXR1和FXR1在邻近DNA结合域的铰链区多4个氨基酸残基〔a-minoacidresidue,aa〕的插入片断，导致其与靶基因启动子FXRE结合的亲和力降低。四种剪接变异体的组织表示出分布不同，除了全部在肝脏高表示出，FXR1与和FXR2在回肠高表示出，在肾脏中度表示出，在胃、十二指肠和空肠低表示出〔1与2各占50%〕;而FXR1与FXR2在回肠和肾上腺中度表示出〔1与2各占50%〕.四种变异体对靶基因的转录激活能力也存在差异，其激活SHP和BSEP的能力相当，而激活ILBP的能力FXR2FXR2〕FXR1=FXR1,最大差异超过20倍[9].在FXR全身敲除小鼠的肝脏特异性过表示出FXR2或FXR2,均可极大程度纠正FXR敲除所致的肝脏基因表示出谱改变，但在降低已升高的HDL水平、转录抑制类固醇12羟化酶〔sterol12-hydroxylase,CYP8B1〕的肝表示出、增加胆汁池亲水性、促进中性甾醇经小肠排入粪便等方面，FXR2的作用强于FXR2.〔二〕FGFR4成纤维细胞生长因子受体FG-FR4被FGF15/19激活后介导FXR的负调节通路。FGFR4基因包含18个外显子，蛋白为一次跨膜的受体型酪氨酸蛋白激酶，有3个细胞外免疫球蛋白〔immunoglobulin,Ig〕样构造域。华而不实外显子1不翻译，外显子2编码信号肽，外显子3编码第1个Ig样构造域，外显子4编码酸盒〔acidbox〕,外显子5和6编码第2个Ig样构造域，外显子7和8编码第3个Ig样构造域，外显子9编码跨膜区，外显子10-12;14-17编码激酶构造域。在人乳癌细胞系发现一种可溶性FGFR4〔solubleFGFR4,sFGFR4〕,由于内含子4的保存，产生提早终止密码子，sFGFR4分泌到细胞外，可抑制FGF-1介导的信号传导。而在人的胃肠道上皮细胞发现另一种可溶性svFGFR4,编码跨膜区的外显子9被内含子9取代，蛋白分泌到细胞外。在小鼠发现两种FGFR4剪接变异体FGFR4-17a和FGFR4-17b,分别纳入内含子17的部分和全长序列，揣测蛋白质缺少羧基端细胞内尾。小鼠生肌细胞中的FGFR4〔-16〕缺少外显子16,缺失激酶构造域。而人垂体瘤来源的FGFR4〔pituita-rytumor-derivedFGFR4,ptd-FGFR4〕mRNA序列从外显子5开场，编码蛋白缺乏氨基端的信号肽和前两个Ig样构造域，蛋白定位于细胞浆，并且组成性磷酸化[10].〔三〕RXR核受体RXR〔NR2B1〕在小鼠睾丸发现2个剪接变异体mRXR2和mRXR3,分别用了不同的选择性外显子1b和1c,而外显子2及之后的序列与原有主要亚型mRXR1一样。mRXR2和mRXR3编码一样的蛋白，与mRXR1相比缺少氨基端的28aa,转录激活功能域1〔activa-tionfunction-1,AF-1〕受影响。mRXR2和mRXR3仅表示出于睾丸，在青春期高表示出，可能在生精经过起作用。随后在人也发现2个剪接变异体hRXR2和hRXR3,hRXR2与原有主要亚型hRXR1共用外显子2及之后的序列，编码蛋白缺少氨基端的27aa,hRXR3与hRXR1共用外显子3及之后的序列，编码蛋白缺少氨基端的97aa.hRXR3表示出于脑、脾和前列腺，而hRXR2表示出水平过低检测不到。hRXR2和hRXR3具有与hRXR1类似的转录活性和对配体的剂量反响曲线，但参加共激活因子后剂量反响曲线出现差异[11].〔四〕LXR核受体LXR〔NR1H3〕已在人发现4个剪接变异体hLXR2、hLXR3、hLXR4、hLXR5.hLXR2应用选择性外显子1,伴有启动子改变，氨基端缺少45aa,使转录活性减低，仅在睾丸高表示出。hLXR3的外显子6被跳过，导致配体结合区缺少50aa,不能与配体结合，无转录活性。虽然hLXR3可竞争性抑制原有主要亚型hLXR1,但不具有显性失活作用，且hLXR3在各组织低表示出。hLXR4因保存了内含子6的192bp,配体结合区有64aa的插入片断，具有微弱的转录活性。LXR3和LXR4在小鼠组织也有低水平表示出。hLXR5在外显子7和外显子8之间纳入了一个选择性外显子，含有终止密码子，导致羧基端序列缺失91aa.hLXR5可与辅阻遏物互相作用，过表示出时抑制hLXR1的转录活性[12].〔五〕ASBT顶膜钠依靠性胆汁酸转运体ASBT.〔SLC10A2〕为七次跨膜蛋白，由384个aa构成，氨基端位于细胞外，羧基端位于细胞内。已发现一个选择性剪接变异体t-ASBT,由于外显子2的跳过引起移码，产生154aa的短亚型，仅保存氨基端的三个跨膜区。选择性剪接引起转运体的亚细胞定位和功能改变：ASBT位于肠上皮细胞、胆管细胞和肾脏近球小管上皮细胞的顶侧膜，将管腔中的胆汁酸转运到细胞内；而t-ASBT位于上皮细胞的基底膜，将细胞内的胆汁酸转运排出细胞。在胆管细胞ASBT与t-ASBT均被负反应调节，而在肠上皮细胞二者均被正反应调节[13].可见ASBT与t-ASBT位于细胞两侧，协同调节胆汁酸的转运。〔六〕NTCP钠-牛磺胆酸共转运多肽NTCP.〔SLC10A1〕为七次跨膜蛋白，由362个aa构成，氨基端位于细胞外，羧基端位于细胞内。NTCP位于肝细胞窦状隙膜，将门静脉血流中的胆汁酸转运到肝细胞内。已发现一个选择性剪接变异体NTCP2,最后一个内含子的保存使终止密码子提早出现，蛋白的羧基端变短，共含317aa.全长NTCP为低亲和力/高容量转运体，而短的剪接变异体NTCP2为高亲和力/低容量转运体[14].〔七〕OATP1B3位于肝细胞窦状隙膜的有机。阴离子转运蛋白OATP1B3〔SLCO1B3〕摄取游离胆汁酸，仅表示出于肝脏。而在结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等癌组织发现了一种OATP1B3剪接变异体的广泛表示出，称为癌特异性OATP1B3〔cancer-specificOATP1B3,csOATP1B3〕.csOATP1B3的转录起始于选择性外显子2a,缺少外显子1和2,导致氨基酸序列在氨基端缺少28aa[15].csOATP1B3的亚细胞定位也显着改变，主要位于细胞浆，仅有少量转位到细胞膜。转录起始位点的改变伴有启动子改变，产生不同的转录调节形式[16].〔八〕MRP4多药耐药相关蛋白MRP4〔ABCC4〕定位于肝细胞窦状隙膜，将肝细胞内的胆汁酸泵入体循环；在肾脏定位于近球小管上皮细胞顶侧膜，将肾小管上皮细胞内的胆汁酸泵入管腔，促进胆汁酸由尿