探讨杏转基因植株的抗寒性,园艺学论文

探讨杏转基因植株的抗寒性,园艺学论文杏属〔ArmeniacavulgarisLam.〕共有10个种，中国有9个种，13个变种，2000余个品种和类型〔赵锋等，2005〕。大果杏源产于山东省德州市，属于华北生态群品种，树势强健，树姿半开张，不完全花比率低，成花容易，坐果率高，结果较早，果实品质优良。该品种早熟丰产，耐瘠薄，耐干旱，设施栽培成功率较高〔王金政等，2005〕，其栽培管理较其他品种简单，且用处极为广泛，现已在山东省及黄河流域其它地区广泛种植，并成为该地区经济效益较高的杏树品种〔魏敏，2003〕。杏在荒山绿化、退耕还林和果树种植调整中发挥着重要作用〔陈学森等，2001〕。杏树开花早，易遭早春晚霜危害，轻则造成减产，重者甚至绝收〔孙仲序等，2005〕。据统计，2001年山东邹平因低温冻害，全县杏经济损失8000万元；同年山东泰安大果和凯特杏受冻均在90%以上。因而解决杏树早春晚霜冻害具有重要的意义。植物的抗寒性是其对低温严寒环境的长期适应，由遗传变异和自然选择获得的一种能力〔Glerum，1985〕，是对低温长期适应的一种遗传特性。由于木本植物的多年生和木质化构造的特性，对低温比草本植物有更高层次的抵抗能力，因而，从木本植物中应该更容易分离到有较强抗寒能力的基因〔Wellingetal.，2002〕，这也是改进林果树种的一个重要方向。植物EBP1与人体内EBP1的构造和功能类似性，是近年发现的一种新型蛋白质，被以为是重要的转录因子和转录共调节因〔Yooetal.，2000〕。EBP1是增殖相关蛋白2G4〔PAZG4s〕家族的一员，真核细胞中PZG4蛋白高度保守〔Zhangetal.，2003〕，介入多个信号传导通路，与细胞周期、蛋白质的转录翻译相关，影响细胞的增殖和分化〔Zhangetal.，2003；Horvathetal.，2006〕。AmEBP1是从沙冬青〔AmmopiptanthusmongolicusChengf.〕中克隆〔Caoetal.，2018〕的与低温胁迫相关的基因，该基因是第1个被证实能提高转基因植物抗寒性的核糖体相关蛋白基因，通过促进核糖体的合成以及冷诱导中转录因子和下游起保卫作用的蛋白的翻译而起作用。所以AmEBP1既对低温信号的转导经过有重要作用，也在植物对低温的长期适应中发挥重要作用。花粉管通道法转化外源基因，操作简便，已在番茄、番木瓜、苹果、核桃等果树上获得成功〔牛庆霖等，2020〕。本研究中将沙冬青AmEBP1通过花粉管通道法导入大果杏幼胚中，经抗性挑选及分子检测，在改进WPM培养基上培养阳性植株，讨论转基因植株的抗寒性，为下一步抗寒杏新品种选育提供参考。1、材料与方式方法1.1试验材料将沙冬青AmEBP1完好的开放阅读框用PCR方式方法克隆出来，插入PBS-T克隆载体，PCR方式方法鉴定与LacZ编码方向一致的中间载体，用XbaⅠ和SalⅠ酶切，同时双酶切载体pCAMBIA2300〔中国科学院遗传与发育生物学研究所惠赠〕，用T4DNA连接酶，以6︰1浓度比，16℃链接12h，获得表示出载体pCAMBIA2300-AmEBP1，冻融法转化到大肠杆菌DH5中，卡那霉素挑选阳性菌株，4℃下保存备用。授粉试验于泰安市泰山林业科学研究院试验基地进行，采集凯特杏花粉4℃保存。1.2花粉管导入外源AmEBP1采用碱裂解法提取目的AmEBP1菌液〔Luetal.，2001〕。经纯化后的质粒DNA溶于pH7.6的TE缓冲液中，A260/A280比值在1.9左右。于2020年4月初大果杏花大蕾期人工去除个别花蕾未膨大和未开放的花，对开放的花去雄授凯特杏花粉，3h后取5LAmEBP1DNA溶液涂抹柱头2~3次〔Tangetal.，2005〕。以未转化的花为对照。于盛花期后30d，取幼胚，用70%酒精、0.1%升汞灭菌，无菌水冲洗3~4次，剥去种皮，接种在改进WPM培养基〔附加Kan50mgL-1+6-BA0.8mgL-1〕上培养，挑选出的芽团用作分子检测。阳性材料接种到改进培养基〔WPM+IBA0.2mgL-1〕上生根成苗培养用于抗寒试验。1.3转基因植株的PCR检测按CTAB法提取转化植株和对照植株基因组DNA，AmEBP1质粒DNA作为阳性对照：正向引物：5-ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3；反向引物：5-TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3。反响体系：反响总体积为25L，包括2.5L10Buffer、0.4mmolL-1dNTP、2mmolL-1MgCl2，1UTaqDNApolymerase、1L正向引物、1L反向引物、1L模板DNA〔DNA浓度10ngL-1〕，ddH2O加至终体积25L。反响程序：94℃，5min预变性；94℃变性40s，55℃扩增40s，72℃延伸1min，35个循环；最后在72℃延伸5min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.4转基因植株的Southern检测CTAB法提取PCR阳性的转基因植株和对照植株DNA，由北京美莱博医学科技有限公司进行PCR标记法Southern检测〔牛庆霖等，2020〕。详细方式方法：XbaⅠ和SalⅠ双酶切AmEBP1质粒DNA，DIG-dUTP标记〔地高辛杂交检测试剂盒〕，得到1200bp的片段为标记探针；使用美莱博DIGD-110地高辛杂交检测试剂盒Ⅱ〔化学发光法〕〔Sambrooketal.，1989〕进行洗膜、信号检测。1.5转基因植株的抗寒能力测定将Southern杂交检测为阳性的植株与对照，在培养基〔改进WPM+6-BA0.8mgL-1〕上进行芽团扩繁增殖到一定基数，每瓶4株，改进培养基〔WPM+IBA0.2mgL-1〕上继续培养，选择长势相近的对照苗进行试验。抗寒能力测定参照孙海伟等〔2020〕的方式方法并作改良，4℃预处理4h，然后分别在4和8℃冷冻处理3、6、12、24和48h，每处理5瓶。冷冻处理结束后，在4℃，黑暗条件下解冻3h，然后24℃光照培养2d，统计存活率。将Southern检测为阳性的植株与长势相近对照苗置于4℃光照培养24h，然后置于0、4、8、12和16℃各处理12h，之后4℃解冻12h，每个处理取5瓶，每瓶4株，采用膜浸透电解质外渗法〔郭卫东等，2018〕测定叶片相对电导率〔REC〕以表示细胞膜透性，重复3次，用DPS软件进行分析、比拟。MDA的含量测定参照牛庆霖等〔2020〕的方式方法。根据测定所得的REC，应用EXCEL、DPS软件进行非线性回归分析，参照郭卫东等〔2018〕的方式方法，测定转基因植株的半致死温度LT50〔Semilethaltemperature〕。2、结果与分析2.1转AmEBP1基因组培杏苗的分子鉴定2.1.1PCR检测经花粉管通道法转化AmEBP1基因的大果杏幼胚，在改进WPM培养基上由芽团进行多代扩繁。提取嫩叶DNA为模板，以载体质粒DNA为阳性对照，未转化的大果杏为阴性对照，进行PCR扩增。结果显示在扩繁的材料中有6个转基因株系PCR结果为阳性〔图2〕。2.1.2Southern检测将PCR扩增结果阳性的6个株系转基因大果杏和对照植株同时采用地高辛标记法进行Southern检测，结果表示清楚，未转基因的对照植株没有出现杂交带，转基因植株中有5个株系分别出现1~3条杂交带，讲明AmEBP1基因已经通过花粉管通道法整合到这5个株系的基因组DNA中〔图3〕。将阳性株系扩增到一定数量，用于下一步抗寒试验。2.2转基因株系抗寒能力检测对得到的5个转基因阳性株系进行增殖扩繁，接种到改进WPM+IBA0.2mgL-1培养基上继续培养。选取长势相近，苗高8~10cm，叶片浓绿，生长强健的组培苗和对照苗进行抗寒试验。转基因植株在4℃下处理3、6和12h后，复苏培养均有较高的存活率〔95%、85%和66.7%〕，处理12h后存活率急剧下降，处理48h，解冻复苏培养后仍有10.2%的植株存活；对照植株在4℃处理3h后受冻害现象明显增加，处理12h后基本全部死亡〔图4〕。8℃处理转基因植株，3h后冻害明显，处理12h后，解冻复苏培养仅有16.3%的植株存活〔图4；图5，A6h、A12h〕，24h后基本死亡〔图5，A24h〕；8℃处理未转基因对照植株12h后〔图5，B12h〕，基本不能复苏。以上结果显示：4和8℃低温处理下，转基因植株比未转基因对照植株的存活率高。2.3低温处理对影片细胞膜透性的影响如此图6可见，随着处理温度的降低，植物叶片受伤害程度加重，在8~16℃，转基因植株叶片相对电导率值一直低于相应的对照，讲明转基因植株受低温损伤程度较对照较轻；对照REC值在8℃时到达峰值，而转基因植株REC在12℃时最大，二者峰值相差11.2%；低温处理经过中，植物材料体内MDA一直在积累，在4~16℃条件下，对照植株始终高于转基因植株，讲明转基因大果杏低温处理下叶片损伤程度比对照轻。2.4转基因植株的半致死温度应用电导法测定不同低温处理的植物组织，在不同温度下植物组织电解质外渗的累积量总是呈S形曲线，Lyons和Raison〔1970〕把低温对植物细胞膜伤害经过用Logistic曲线加以表示，并将曲线的拐点作为低温半致死温度。半致死温度主要反映了温度、水分与抗寒性之间的数量关系，大量研究表示清楚，植株叶片半致死温度LT50的高低能够表示抗寒性的相对大小〔沈洪波等，2002〕。本研究表示清楚，转基因株系的LT50是5.80℃，未转基因对照为3.67℃，理论上讲明转基因株系的抗寒能力明显好于对照植株，这与转基因植株在抗寒试验中存活率的结果一致。3、讨论温度是限制植物生长、发育及其地理分布的一个重要因素，低温造成的冻害对杏及其他果树和经济林木威胁很大〔ShinozakiYamaguchi-Shinozaki，1996；Thomashow，1998〕。关于木本植物抗寒基因的研究与草本植物相比拟为落后。自费云标等〔1994〕从沙冬青中分离出了第1个来自于木本植物高热滞活性的AFP，随后，Cao等〔2018〕采用cDNA-AFLP方式方法，从沙冬青中克隆得到了能提高植物抗寒性的核糖体相关蛋白基因AmEBP1，并试验证明AmEBP1加强了转基因植物的抗寒性是通过促进核糖体的合成以及冷诱导中转录因子和下游起保卫作用的蛋白的翻译而进行的。随后沙冬青极强的抗冻能力引起了分子生物学家的极大兴趣，利用木本植物分离得到相关抗性基因，再转化到木本植物，如今已经成为植物抗性育种的新途径〔Songetal.，2020〕。近年来，果树上的转基因研究日趋深切进入，果树大多为杂合体，后代基因易分离，因而利用转基因手段，将目的基因转化到受体材料，按无性方式进行繁育，以获得目的性状的果树新品种。1988年基因转化首先在核桃〔JuglansregiaL.〕上获得突破，McGranahan等〔1998〕获得了转gus基因核桃再生植株，现已在20多种果树上获得了转化体或转化植株。王淑芳等〔2001〕将胆碱脱氢酶基因成功转化到番茄中，得到转基因番茄；王燕霞〔2018〕利用农杆菌介导法将抗寒转录因子CBF基因转入嘎拉苹果中，PCR检测并获得转基因阳性株系。中国在樱桃〔Cerasus〕、草莓、苹果等果树转基因方面做了很多研究工作，并获得了转基因植株，十分是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间试验，该项研究处于国际领先水平。本研究中将源于沙冬青的抗寒基因AmEBP1转化到大果杏中，讨论其转化后的抗寒性能，以期解决早春严寒低温对冻花、冻果的影响，为抗寒杏品种的选育提供参考。基因转化的方式方法主要有农杆菌介导和外源DNA直接导入，花粉管通道法是DNA直接导入的一种方式，其方式方法是将外源基因，通过花粉管进入胚珠，在植物体进行受精的经过中，胚囊内的精细胞与卵细胞均没有细胞壁，融合构成合子，早期未分化的合子近似于感受态细胞，易于接受外源DNA。方清〔2002〕将红树〔Rhhoraapicutota〕总DNA导入番茄，选育耐盐番茄；冯莎莎〔2007〕将pWBvecloa质粒DNA导入富士苹果，对转化植株进行了相关抗性分析；王晓蔓〔2018〕对影响核桃花粉管通道法转化因子进行了研究。花粉管通道法转化技术已经在果树转基因育种中有所运用，本研究利用花粉管通道法，将沙冬青抗寒基因AmEBP1转化到大果杏中，利用幼胚培养，经卡那霉素挑选，PCR、Sou