功能基因序列分析案例

青霉素基因序列分析摘要：青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。近年来，由于滥用抗生素，导致了大量耐药性菌株的出现，严重威胁着人类的健康，现在细菌耐药性已成为全球关注的医学与社会问题。本文以青霉素为例，阐述一种通过构建系统发育树研究不同青霉素间亲缘性，来研究细菌青霉素抗性的方法。关键词：青霉素；基因序列；邻接法；系统发育树引言一、 青霉素简介青霉素（Penicillin，或音译盘尼西林）是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是由青霉菌中提炼出的抗生素。青霉素属于0—内酰胺类抗生素（p-lactams），0—内酰胺类抗生素包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类、单环类、头霉素类等。青霉素是很常用的抗菌药品。但每次使用前必须做皮试，以防过敏。青霉素是人类最早发现的抗生素，1928年英国伦敦大学圣玛莉医学院（现属伦敦帝国学院）细菌学教授弗莱明在实验室中发现青霉菌具有杀菌作用⑵，1938年由麻省理工学院的钱恩、弗洛里及希特利（NormanHeatley，1911-2004）领导的团队提炼出来。弗莱明因此与钱恩和弗洛里共同获得了1945年诺贝尔生理医学奖。青霉素类抗生素是0-内酰胺类中一大类抗生素的总称，它们具有相似的作用机理。细菌一般都处于低渗（即外界的渗透压低于细菌体内部）的环境中，因而会自发地吸收外界的水分。为了防止细胞因吸水过多而膨胀炸裂，细菌在其细胞壁中合成一种名为肽聚糖的物质，以此抵抗细菌体的自发吸水膨胀。青霉素即作用于肽聚糖的合成过程中，阻止它的合成，进而导致细菌体失去抵抗渗透压的能力而胀破。二、 抗生素抗性的产生细菌抗药性产生的原因主要包括以下几种：（1）通过对抗生素的降解或取代活性基团，改变抗生素的结构，使抗生素失活；（2）通过对抗生素靶位的修饰使抗生素无法与之结合而表现出抗性；（3）通过特异或通用的抗生素外排泵将抗生素排出细胞外，降低胞内抗生素浓度而表现出抗性；（4）其他抗性机制包括在细胞膜上形成多糖类的屏障减少抗生素进入细胞内［1］。抗生素耐药性发生与传播与抗生素的使用直接相关，任何抗生素使用均可以导致抗生素耐药性的发生［2］。抗生素耐药性问题早在抗生素使用之初就为学者所认识。自20世纪60年代耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）报道以来，随着更多抗生素特别是广谱抗生素如广谱0-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素等的广泛应用，耐药性的发生与传播越来越严重，且在上世纪90年代学者们已开始警告“后抗生素时代”的到来［3］。WHO在2001年也提出了需要全球采取紧急行动控制抗生素耐药性，并从抗生素使用（包括人与动物）、药物和疫苗开发、药品促销、耐药性监测及各国政府和卫生系统多个方面探讨控制耐药性问题的干预措施。在过去的10年里，抗生素耐药性已是公共卫生所面临的最大挑战之一，许多因素继续造成众多不必要的抗生素使用及浪费抗生素这一重要公共卫生资源［4］。三、 构建系统发育树对鉴定生物间亲缘关系的意义

本文通过NCBI数据库查找相关青霉素的基因序列，并利用MEGA软件通过邻接法构建系统发育树。数据库(Database)是按照数据结构来组织、存储和管理数据的仓库，它产生于距今六十多年前，随着信息技术和市场的发展，特别是二十世纪九十年代以后，数据管理不再仅仅是存储和管理数据，而转变成用户所需要的各种数据管理的方式。数据库有很多种类型，从最简单的存储有各种数据的表格到能够进行海量数据存储的大型数据库系统都在各个方面得到了广泛的应用。系统发育树也称系统进化树，它是用类似树状分支的图来表示各种生物之间的亲缘关系，过对生物序列的研究来推测物种的进化历史，主要是通过DNA序列、蛋白质序列、蛋白质结构等来构建系统发育树。研究系统发育树的目的可以重建祖先序列P性状；估计来自于同一祖先的不同生物之间的分歧时间;识别和疾病关联的突变等近些年随着基因数据的爆炸增长，系统发育树的构建越来越流行。构建系统发育树在理解生物物种的进化历史、为疫苗绘制病原体多样性图谱、为流行病学的研究提供帮助、为新颖基因的功能预测提供帮助、为生物多样性研究等领域具有重要意义。四、青霉素基因序列下载1、蛋白质序列下载流程NCBI一Nucleotide(Penicillin)一search一点击要下载的序列一sendto一file一fhsta一createfile一选择保存位置一对文件命名一保存Nucleoti-de |▼||penicillinSawesearizhLimitsAdvancedSendto:Sendto:®Filter@File ©Clipbnard©CollectionsDownload2items.FormatrASTA曰Sort|_DefauItord@「CrestsFile拍sequences.Nucleotide(81224)EST[50504)GSS224Selected2 First PatDNAGl：30407153/日时心，lor~chromosorn已ccmplistisgenomeDIXIA2、目的基因序列(Penicillin-1)TTTTTTTTTCAGAAAAAAATTTGATATTCGCCCTT CTAGTGAATAAAAAA五、应用MEGA软件分析基因序列1、基因序列对齐基因序列对齐流程打开MEGA软件一Edit一InsertSequencefromfile一选择所要分析的蛋白质序列文件一打开一将不对齐的序列删除一将对齐后的蛋白质序列保存基因序列对齐DataEditSearchAlignmentWebSequencerDisplayHelp□■□■J件老妣蹄w智s龟S曜)X愉演41 I卜融磐竦野ONASequencgg7ranslaiedProleinSequencesrlllcrlllc-T1一pencilliD1 TJUirc|L.J.■J27TICCt&C GTTiGTlTCTtillG2.gi|33233DS1： 部料箭目两能际问配廉回日朔期曰E目氓昨丽晌南限国廨目^llb3.gl|32141095 ...仁匚目际自E日函匪目目匚@甫g匚g明目匚§际既朋&R用目匚目用自^llb5,(III3332095^! ..H.IgG｛瓯匝昵日虚E丽际施阑己自豳®响虚施官加阻白雨丽8《•叫皿酣海：mi3叫曲关氟2、构建发育树(1)构建发育树流程(1)构建发育树流程打开MEGA软件一Analysis一phylogeny一选择邻接法Construct/TestNeighbor-JoiningTree一选择要分析的基因序列文件一打开一出现AnalysisPreference窗口一Compute一出现TreeExplorer窗口一蛋白质序列的发育树建成(可对所建的发育树进行调整)一将所建发育树保存(可保存为pdf格式：image一SaveasPDFfile) penicillin3——penicillin7 penicillin1penicillin4 penicillin6—penicillin2 penicillin52系统发育树(2)目的蛋白质序列同源性分析结果从所建发育树可知，Cellulase-13与Cellulase-1的同源性最大。六、青霉素基因序列分析结论本文通过运用NCBI数据库、MEGA软件对青霉素(Penicillin-1)序列与其他6个基因序列进行建树来分析他们之间的同源性，根据这7个蛋白质序列所建成的发育树可看出，Penicillin-3与Penicillin-7的同源性最近，Penicillin-2与Penicillin-5同源性近Penicillin-1与Penicillin-3和Penicillin-7的同源性更近。因此，如果某菌株对Penicillin-3和Penicillin-7具有抗性，那么它对Penicillin-1也可能有抗性；如果它对Penicillin-2和Penicillin-5有抗性而对Penicillin-3和Penicillin-7敏感，那么它也很有可能会对Penicillin-2和Penicillin-5有抗性而对Penicillin-1敏感。参考文献：AlekshunMN,LevySB(2007)Molecularmechanismsofantibacterialmultidrugresistance.Cell,128,1037-050.GoossensH.Antibioticconsumptionandlinktoresistance[J].ClinMicrobiol