麻疯树提取物体外抗病毒和杀菌作用的初步研究

麻疯树提取物体外抗病毒和杀菌作用的初步研究刘娟，雷蕾，唐琳，李昱星，陈放【内容摘要】目的研究麻疯树提取物的体外抗病毒和杀菌作用，为进一步提取分离有效成分提供实验根据。方法采取细胞培养技术，观察麻疯树1，2，3号提取物对单纯疱疹ⅰ型病毒〔hsv-ⅰ〕、单纯疱疹ⅱ型病毒〔hsv-ⅱ〕和流感a3型病毒〔a3〕的直接灭活作用以及抑制它们增殖的作用；采取悬液定量杀菌法，观察麻疯树1号提取物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭作用。结果麻疯树1，2，3号提取物对细胞的毒性较小；提取物既能抑制单纯疱疹病毒在胞内的增殖，又能直接灭活该病毒；总体而言，提取物对hsv-ⅰ在胞内增殖的抑制造用略优于hsv-ⅱ，对hsv-ⅰ的直接灭活作用更是显著强于hsv-ⅱ；提取物对a3的直接灭活作用效果显著；3号提取物还能抑制a3在鸡胚内的增殖。麻疯树1号提取物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有极强的杀灭作用。结论麻疯树提取物具有体外抗病毒、杀菌的作用。【本文关键词语】麻疯树提取物抗病毒杀菌abstract：objectivetoprovideanexperimentalevidenceforfurtherextractionandseparationofactivecomponents,weinvestigatedtheantivirusandbactericidaleffectsofextractsfromjatrophacurcasl.invitro.methodsweappliedthemethodofcellculturetoobserveextractsfromjatrophacurcasl.,no.1,2,3,directlykillingherpessimplexvirus(hsv-ⅰⅱ)andinfluenzavirusa3,aswellasinhibitingtheirproliferationincells.inanotherexperiment,weobservedthebactericidaleffectofno.1extractfromjatrophacurcasl.oncandidaalbicans,staphylococcusaureausandescherichiacoli.resultstheextractsfromjatrophacurcasl.,no.1,2,3,hadlowercytotoxicity.alltheextractscouldinhibitherpessimplexvirusfromproliferatingincellsanddirectlykillthevirus.theirinhibitoryactionontheproliferationofhsv-ⅰwasalittlebetterthanⅱ,whiletheirinhibitoryeffectonhsv-ⅰwasobviouslystrongerthanⅱ.alltheextractswereabletokillinfluenzavirusa3directly,andextractno.3couldinhibittheproliferationofthisvirusinembryonatedegg.furthermore,no.1extracthadaverystrongbactericidaleffectoncandidaalbicans,staphylococcusaureausandescherichiasionextractsfromjatrophacurcasl.haveantivirusandbactericidaleffectsinvitro.keywords：jatrophacurcasl.；extracts；antivirus；bactericidal麻疯树jatrophacurcasl.，又名黄肿树、芙蓉树、假花生、亮桐、吗哄罕、桐油树、南洋油桐，属于大戟科〔euphorbiaceae〕麻疯树属jatropha植物，重要分布于热带和亚热带地区［1］。麻疯树全身皆可入药，根、茎皮和叶外用具有消肿散淤、止血、杀虫止痒的功能［2～4］，可用于跌打肿痛、创伤出血、皮肤瘙痒、湿疹等；茎叶内服还能够治疗胆结石［2，5］；另经临床试验证明［6］，其乳汁具有抗病毒作用。近年来还发现麻疯树种子具有显著的抗癌活性［7］。由此可见，麻疯树作为一种新兴的资源植物，在新药开发方面具有宏大的应用价值。1材料1.1细胞非洲绿猴肾〔vero〕传代细胞，由中国科学院西苑医院基础研究中心病毒室提供。1.2鸡胚九日龄鸡胚，购自院。1.3病毒单纯疱疹ⅰ型病毒株〔hsv-ⅰ〕、单纯疱疹ⅱ型病毒株〔hsv-ⅱ)和流感a3型病毒株〔a3〕，由中国预防医学科学院病毒所提供。hsv-ⅰ和hsv-ⅱ经vero细胞增毒后，分别采集，备用。a3经九日龄鸡胚增毒后，其红细胞凝血效价为1∶160，采集，备用。1.4菌种白色念珠菌〔candidaalbicans，atcc10231〕第5代培养物，金黄色葡萄球菌〔staphylococcusaureaus，atcc6538〕第4代培养物，大肠杆菌〔escherichiacoli，atcc8099〕第4代培养物，均由四川省疾病预防控制中心提供。1.5药物麻疯树提取物：麻疯树干叶60%乙醇的浸提液，经低压浓缩并冷冻枯燥后制得黑褐色粉末，编为1号，含生药10g/g。以上述浸提液为原料，以大孔树脂吸附层析法进行梯度洗脱，采集30%和50%乙醇洗脱的产品，经低压浓缩并冷冻枯燥后制得粉末为黄绿色和棕黄色，对应编为2号和3号，分别含生药33g/g和100g/g。阿昔洛韦滴眼液，1mg/ml，武汉五景药业生产，批号为07010904。病毒唑打针液，100mg/ml，宜昌三峡制药厂生产，批号为20070311。1.6仪器与试剂96孔细胞培养板；co2孵箱〔日本yamato科学股份有限公司〕；倒置显微镜〔重庆厂，型号：1833670〕；微孔滤器。dmem干粉培养基〔美国invitrogen公司，批号：1290007〕、胎牛血清、吐温。细胞生长液〔含10％胎牛血清〕、维持液、消化液以及胰酶液〔含2％胎牛血清〕等按〔医学病毒学基础及实验技术〕［8］配制。胰蛋白胨大豆琼脂培养基〔tsa〕、胰蛋白胨大豆肉汤培养基〔tsb〕、磷酸盐缓冲液〔pbs〕等按〔消毒技术规范〕［9］配制。2方法与结果2.1药物体外抗单纯疱疹病毒〔hsv〕实验［8］2.1.1hsv对vero细胞的毒力测定将长成单层的vero细胞用胰酶液消化成单个细胞，以细胞生长液调整细胞数至8.0×104ml。按每孔0.1ml参加96孔细胞培养板内，放在37℃，5%co2孵箱中培养24h。待96孔细胞培养板内的vero细胞长成单层后，取上述制备好的hsv-ⅰ和hsv-ⅱ毒株，用维持液将其分别做10倍系列稀释(10-1～10-10)，然后按0.1ml/孔接种于细胞培养板内的vero单层细胞中，每浓度6个复孔，同时设细胞对照。置37℃，5%co2孵箱中培养7d，每日观察并记录细胞病变〔cytopathiceffect，cpe〕，测定组织细胞半数感染量(tcid50)。结果见表1。表1单纯疱疹病毒的毒力测定〔略〕根据reed-muench氏法［8］计算，hsv-ⅰ和hsv-ⅱ的tcid50分别为10-4.6/ml和10-3.7/ml。在“2.1.3〞和“2.1.4〞项实验中，所用病毒液浓度为100tcid50/0.1ml。2.1.2药物对vero细胞的毒性实验用维持液分别将1，2，3号药物作系列倍比稀释，药液浓度梯度为2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125mg/ml，参加96孔细胞培养板的vero单层细胞中，0.1ml/孔，每实验组4个复孔，同时设细胞对照和阿昔洛韦对照〔阳性对照〕。置37℃，5%co2孵箱中培养，观察cpe，并记录各药物的最大无毒浓度〔tc0〕，共7d。最后，根据reed-muench氏法［8］计算出各药物的半数有毒浓度〔tc50〕。经观察，各药物对细胞的毒性都较小。计算得知麻疯树1，2，3号提取物的tc0和tc50依次为：0.25mg/ml和0.56mg/ml；0.25mg/ml和0.53mg/ml；0.125mg/ml和0.14mg/ml。2.1.3药物对hsv在细胞内增殖的抑制造用将100tcid50/0.1ml的hsv-ⅰ接种于96孔细胞培养板的vero单层细胞中，0.1ml/孔，置37℃孵箱内吸附1h。同时，以tc0为各药的起始浓度，将1，2，3号药物作系列倍比稀释，备用。待病毒吸附后，取出孵箱内的细胞培养板，倒掉其中液体，用维持液洗两次，再分别参加预先稀释的各药液，0.1ml/孔，每个实验组4个复孔，同时设细胞对照、病毒对照以及阿昔洛韦对照。置37℃、5%co2孵箱中培养，每日观察cpe，当病毒对照组的cpe达“++++〞时，〔注：“－〞表示无细胞病变；“+〞表示有25%细胞病变；“++〞表示有50%细胞病变；“+++〞表示有75%细胞病变；“++++〞表示有100%细胞病变。〕终止实验。根据上述方法，以hsv-ⅱ进行一样实验操作。结果见表2。并根据reed-muench氏法［8］计算出1，2，3号药物对不同病毒的ec50(半数有效浓度)，以治疗指数(ti，therapeuticindex)来评价药物抑制病毒在细胞内增殖的作用，记为ti1，ti1=tc50/ec50。结果见表3。表3麻疯树提取物抑制单纯疱疹病毒增殖的治疗指数〔略〕由表2可见，1，2，3号药物均能抑制hsv在细胞内的增殖。其中1号和2号药物在0.25mg/ml时能够100%抑制病毒的增殖，而3号药物在0.0625mg/ml即可到达完全抑制病毒增殖的作用。由表3可见，药物对hsv-ⅰ的治疗指数以3号最高，达7.00，1号最低，仅为3.11。除此之外，1号和3号药物对hsv-ⅱ的治疗指数一样，均为3.50，略高于2号药物的3.31。总体而言，2号和3号药物对hsv-ⅰ在细胞内增殖的抑制造用强于对hsv-ⅱ的抑制造用。表2麻疯树提取物对单纯疱疹病毒在细胞内增殖的抑制造用〔略〕2.1.4药物对hsv的直接灭活作用将预先稀释的1，2，3号药物液〔稀释方法同“2.1.3〞项〕与100tcid50/0.1ml的hsv-ⅰ病毒液等量混合，置37℃温箱内1h。然后接种于96孔细胞培养板的单层vero细胞中，0.2ml/孔，每个实验组4个复孔，同时设细胞对照、病毒对照以及阿昔洛韦对照。再放入37℃孵箱吸附1h。取出，倒掉其中液体，用维持液洗两次后，将维持液按0.1ml/孔加到细胞培养板内，置37℃，5%co2孵箱中培养，每日观察记录cpe，当病毒对照组的cpe达“++++〞时，终止实验。根据上述方法，以hsv-ⅱ进行一样实验操作。结果见表4。计算出1，2，3号药物对病毒的半数有效浓度，记为ec50。同样以治疗指数来评价药物对病毒的直接杀伤作用，记为ti2，ti2=tc50/ec50。结果见表5。表5麻疯树提取物直接灭活单纯疱疹病毒的治疗指数〔略〕由表