第三章细胞生物学研究方法总结

第三章细胞生物学研究方法总结第三章细胞生物学研究方法总结第三章细胞生物学研究方法总结第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态构造的观察方法分辨率：肉眼0.2mm光镜0.2μm电镜0.2nm一、光学显微镜技术（lightmicroscopy）（一）一般复式光学显微镜技术a．光学放大系统：目镜和物镜光镜照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片构成机械和支架系统伊红和美蓝：特异结合b．分辨率D：分开两个质点间的最小距离。蛋白质；品红特异显示0．61λ此中：λ为光源波长DNA所在部位。D＝α为物镜镜口张角N·sinα/2N为介质折射率c.一般光镜样品制备：固定（如甲醛）、包埋（如白腊）、切片（约5μm）、染色（二）荧光显微镜技术（fluorescencemicroscopy光镜水平对特异蛋白定性定位）1．FM包含免疫荧光技术和荧光素直接标志技术2．不一样荧光素的激发光波长范围不一样，因此同相同品可以同时用两种以上荧光素标志。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。（三）激光共焦点扫描显微镜技术（laserscanningconfocalmicroscopy）1．特色：瞬时只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清楚分辨率比一般荧光显微镜提升1.4－1.7倍。经过改变焦平面地址可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。2．共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。（四）相差和微分干涉显微镜技术1．相差显微镜（phase-contrastmicroscopy）光辉经过不一样密度物质产生相位差，相差显微镜将其变为振幅差。它与一般光镜的不一样是其物镜后有一块“相差板”，夸张了不一样密度造成的相位差。2．微分干涉显微镜（differential－interferencemicroscopy）——用的是平面偏振光光经棱镜折射成两束，经过样品相邻部位，再经棱镜会合，使样品厚度上的细小差异转变为明暗差异，使样品产生很强的立体感。二、电子显微镜技术（electronmicroscope）（一）电子显微镜基本知识1．与光镜的基本差异：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像2．分辨本事与有效放大倍数：分辨率0.2nm，比肉眼放大106倍有效放大倍数分辨本事指电镜处于最正确状态下的分辨率。实质状况中，分辨率受样品限制。3．电子显微镜电子束照明系统：电子枪、聚光镜基本构造成像系统：物镜、中间镜、投影镜等真空系统：用两级真空泵不停抽气记录系统：荧光屏或感光胶片成像（二）主要电镜制样技术介绍制样要求：①要求样品很薄（数十纳米）②要求保持精巧构造1．超薄切片技术①固定：保持样品形态构造，甚至超微和分子水平上构造。固定剂：常用饿酸（OsO4）和戊二醛等，其余有物理方法如高频微波。②脱水③包埋：使样品中各种细微构造获取支撑，使切片连续完好并有足够强度。包埋剂常用环氧树脂。④切片：厚度40-50nm，经过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。切片刀：玻璃或钻石刀，常用玻璃刀。切片置于覆有支持膜的载网上。⑤染色：用重金属盐染色。如锇酸染脂肪、铅盐染蛋白质、醋酸铀染核酸等。经过电子束振幅的改变只好获取黑白图像。还可以与其余技术结合。2．负染色技术（negativestaining）用的是重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，载网上铺上重金属盐，衬托出样品。3．冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术冷冻断裂：迅速低温冷冻样品（液氮或液氦中），而后样品在其构造相对纤弱的部位断裂。用另一些方法加强成效。冷冻蚀刻（freezeetching）：主要用来观察膜断裂面的蛋白颗粒和膜表面构造，不需包埋也不需固定。冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）4．电镜三维重构技术基本步骤：对生物样品在电镜中的不一样倾角下摄影，获取的电镜图片再经变换办理形成复合物三维构造的电子密度图。低温电镜技术、玻璃态、构造生物学。5．扫描电镜技术（scanningelectronmicroscope，SEM）主要用来观察样品表面的面貌特色，用CO2临界点干燥法解决表面张力问题。扫描电镜景深长，成像拥有激烈的立体感。分辨本事可达0.7nm。三、扫描地道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）利用量子力学中的地道效应观察物质表面的面貌。主要装置：XYZ三个方向扫描的压电陶瓷、迫近装置、电子学反响控制系统和数据收集、办理、显示系统。主要特色：①原子原子尺度的高分辨本事，侧分辨率0.1-0.2nm,纵分辨率0.001nm②可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。③非破坏性丈量。原子力显微镜（atomicforcemicroscope）等十余种扫描探针显微镜。第二节细胞组分的解析方法一、用超速离心技术分别细胞器与生物大分子及其复合物差速离心（differentialcentrifugation）：利用不一样的离心速度所产生的不一样离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心：将要分其余组分铺放在含有密度逐渐增添的、形成密度梯度的、高溶解性的、惰性物质溶液表面进行离心，形成不一样的沉降带。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法利用显色剂与被检物质的特别基团反响显色来判断。DNA：福尔根（Feulgen）反响特异显示DNA分布。多糖：PAS反响（即醛基与希夫schiff试剂反响呈紫红色）脂肪酸：四氧化饿（结果呈黑色）、苏丹Ⅲ（深红色）、苏丹黑蛋白质：很多检测方法，如米伦（Millon）反响（红色积淀）、重氮反响、“－SH”酶：大多数固定剂对酶有钝化作用，定性研究时，保持酶活性，与适合底物温育。三、特异蛋白抗原的定位与定性胞内蛋白定位：免疫荧光与免疫电镜蛋白质体外解析定性：免疫印迹和放射免疫积淀。（一）免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）定义：将免疫学方法与荧光标志技术相结合来研究特异蛋白抗原在体内分布的方法。主要包含：荧光抗体的制备、标本的办理、免疫染色和观察记录等过程。一个看法：免疫酶标志技术（即以酶取代荧光素与抗体偶连）。（二）免疫电镜技术该技术相同用抗原抗体反响的原理，能有效提升样品分辨率，在超微构造水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫电镜技术可分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶技术与免疫胶体金技术四、细胞内特异核酸序列的定位与定性采纳原位杂交技术（insituhybridization）：用标志的核酸探针确立特别核苷酸序列。光镜下原位杂交：放射性同位素或荧光素标志探针电镜下原位杂交：生物素标志探针，检测经过抗生物素抗体上的胶体金颗粒。五、利用放射性标志技术研究生物大分子在细胞内的合成动向1．放射自显影技术：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。2．这一技术的独具特色：对细胞内生物大分子的动向研究和追踪（pulse－chase）3．两个主要步骤：①同位素标志的生物大分子前体的掺入②胞内同位素地址显示4．不一样的放射性同位素及其选择（P64）5．显微放射自显影的基本步骤：标志（连续或脉冲）制片敷胶（3－10μm）曝光显影和定影显微镜下观察6．电镜放射自显影技术：与显微自显影不一样的是样品制备与敷胶的要求更为严格。。。六、定量细胞化学解析技术（一）显微分光光度测定技术（microspectrophotometry）该技术利用细胞内某些物质或物质经染色后对特异光谱的汲取对其进行定量测定。包含：紫外光显微分光光度测定法和可见光显微分光光度法。以上方法各自的原理（P65）（二）流式细胞仪（flowcytometry）P65底第三节细胞培育、细胞工程与显微操作技术一、细胞培育（分原核生物细胞、真核单生物细胞、植物与动物细胞以及病毒的培育）（一）动物细胞培育1．原代细胞（primaryculturecell）：从有机体拿出后马上培育的细胞。传代细胞（subculturecell）：适应在体外培育条件下连续传代培育的细胞。2．原代培育步骤：组织块胰酶或胶原酶与EDTA优异的培育环境中（有小牛血清）转动培育3．单层细胞培育：分别呈圆球形的细胞一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成细胞单层，成为单层细胞（singlelayercell）。4．10代40－50代无穷制原代细胞细胞株（cellstrain）细胞系（cellline）几个有名的细胞系：Hela细胞系、BHK21（babyhamsterkidney）细胞系、CHOchinesehamsterovary）细胞系。5．体外培育细胞的形态：成纤维样细胞（fibroblastlikecell）、上皮样细胞6．悬浮方法培育：某些传代细胞。这一方法的长处：同时获取大批细胞。（三）植物细胞培育（分单倍体细胞培育和原生质体培育）单倍体细胞培育①小孢子胚状体单倍体植株主要用花药②愈伤组织引诱分化出芽和根，最后长成植株。

epitheliallikecell原生质体培育：①用纤维素酶去壁为原生质体，无菌培育、引诱分化为植株。用植物体细胞②不一样植物原生质体交融，由此获取体细胞杂交的植株。（四）非细胞系统在细胞生物学研究中的作用（P67－68）非细胞系统：本源于细胞，而不拥有完好的细胞构造，但包含了进行正常生物学反响所需的物质（如功能系统和酶反响系统等）构成的系统。二、细胞工程（cellengineering）主要技术：细胞培育、细胞分化的定向引诱、细胞交融和显微注射等。（一）细胞交融与细胞杂交技术1．细胞交融定义：两个或多个细胞交融成一个双核或多核细胞的现象。2．动物细胞交融：灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如聚乙二醇）介导植物细胞交融：要先用纤维素酶除去纤维素壁。3．电交融技术（electrofusionmethod）：低压交流电场中齐聚，高压电脉冲下交融。4．同核交融细胞（homokaryon）：基因型相同的细胞交融，同步有丝分裂产生有大核的单核子细胞，称为交融核细胞（synkaryon）。异核交融细胞（heterokaryon）：基因型不一样的种内或种间细胞交融（二）单克隆抗体技术（monoclonalantibody）1．基本源理：将B淋巴细胞和肿瘤细胞交融成杂交瘤细胞，该细胞拥有两种亲本细胞的特征，一方面可以分泌抗体，另一方面可以无穷增殖。2．该技术的长处：可以用不纯的抗原分子制备纯一的单克隆抗体。因为产生特异抗体的杂交瘤细胞株可以被分别。（三）细胞拆合与显微操作技术（P70-71）1．细胞拆合：把核和质分别开来，而后把不一样本源的细胞质和细胞核互相配合，形成核质杂交细