单抗制备常见问题分析

第第页单抗制备常见问题分析1.为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？

答：可以从这几个方面一一考虑：

（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种状况应当重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种状况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，假如偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是全部载体中较为优先考虑的蛋白。

（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，具体请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推举的程序相差尽里不超过50%的偏差。

（3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。

（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推举的剂量不要相差两倍以上。

（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，详细操作本站上也有具体的讲解。

（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否胜利或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开头作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫胜利。

2.为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？

答：可以从这几个方面考虑：

（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应当与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应当选用Balb/C小鼠，同时必需使用品系纯正的小鼠。

（2）培育基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。

（3）培育基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。

（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。

（5）接种杂交瘤细胞的培育板过多。一般在5-20块96孔板为宜。

（6）融合后，未准时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜爱把融合的细胞先放在培育瓶中培育，然后再滴到96孔板上。假如在培育瓶中培育的时间过长，也可能消失克隆利率少的状况。

（7）细胞被污染。在显微镜下认真观看是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应当考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。

（8）细胞培育条件不正确，确保细胞培育在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。

（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。

3.为什么融合后得不到阳性克隆？

答：可能的缘由：

（1）动物未免疫胜利就进行了融合。详细解决方法参照本页面第1个问题。

（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。详细解决方法，请参照本页面第2个问题。

（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不行以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，胜利率也有待商榷。

（4）抗原成份与细胞培育条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简洁的例子，假如需要制备抗BSA的单抗，则养杂交瘤的培育基中不行以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最终做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的方法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培育基。再如，假如需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不行以使用脱脂奶粉。

（5）其它全部能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA试验的讲解与争论。

4.为什么我的细胞生长很慢？

答：可能的缘由：

（1）使用了劣质的培育耗材、培育基、血清、HAT或HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行试验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培育试验，依据骨髓瘤细胞的倍增速度的确血清质量。

（2）使用的血清或培育基浓度不正确。认真检查配方是否正确。

（3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面其次个问题。

（4）其它问题，可以参考本页面其次个问题。

5.我的克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？

答：首先要留意的是，正常状况下，杂交瘤也不是肯定稳定的，的确简单发生染色体丢失的状况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更简单发生阳性变为阴性。但是也有一些方法尽量削减阳性变为阴性的方法。一般可以从这几个方面加以留意：

（1）永久保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培育基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到肯定密度的时候，培育基就开头变颜色，这个时候就要预备换培育基了，除了换培育基，同时应当掌握好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培育基不至于很快被消耗。

（2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。

（3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞简单消失死亡或者生长形态发生明显变化。

（4）对于传代次数较多的细胞株需要常常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。

（5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的状况。

6.为什么我做亚克隆后长不出克隆来？

答：亚克隆失败的缘由和克隆不长的缘由类似，但是除此之外，也还有一些独特的缘由。

（1）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。

（2)亚克隆时，没有根据正确的数量取出细胞，在本站有关亚克隆操作的页面上提到过，亚克隆的过程听从泊松分布，假如取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能消失长不出克隆的结果。

（3）未添加饲养层细胞。单个细胞在完全培育基中极难培育，假如不添加饲养层细胞，则它们很可能很快就死亡，最终就长不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的浓度过高，或者未添加HT。虽然HT对杂交瘤的生长并不是必需的，但是HT的确可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。

（5）使用无血清培育基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培育基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的试验的时候，可能会选用无血清培育基来培育杂交瘤，但是需要留意的是，在许多种无血清培育基中，单个细胞是很难长成克隆的。最好的解决方法就是先用含有血清的培育基培育它们，等克隆长出后再把培育基彻底更换为无血清培育基。

7.为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？

答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。对于冻存过程，需要留意：

（1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得特别好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目前认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培育基，不管是哪一种，冻存爱护剂DMSO的含量特别重要，假如这个浓度过低，则起不到爱护作用，冻存的细胞最终会死于冰晶形成时的张力，假如浓度过高，则细胞中毒而亡。假如使用其次个配方，留意肯定要用养过杂交瘤的培育基，而尽量不要用一般的完全培育基，而且肯定是配养需要冻存的那一株的培育基。文献中也有提到用甘油作为冻存爱护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。假如新手的确对这个没把握，市场上也有商品化的冻存液，买回来根据说明书操作就OK了。

（2）冻存过程中，不行用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，由于在DMSO存在的条件下，细胞膜变得特别脆弱，假如用力过猛，则细胞膜很简单破，复苏成活的机会就明显会下降。

（3）冻存的程序也特别重要。实践表明，以每分钟1℃的速度下降冻存细胞是最抱负的。假如条件简易，可以把细胞放在4℃半小时左右，然后再在-20℃放置1-2小时，最终转入-80℃放置过夜，最终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80℃也行。现在市场上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。

（4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很简单进入冻存管。这一点许多人都没有留意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，一般的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，假如放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，最终可能造成细胞污染。

（5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。

对于复苏过程，需要留意：

（1）快速。为了防止升温中细胞内产生冰晶，剧烈建议加快溶化过程。一般都要用用足够体积的37℃热水复苏，并不断晃动冻存管。

（2）复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。

（3）有的人复苏细胞时，没有去掉冻存液，这样就把冻存液里的DMSO带到了新的培育体系里，简单对细胞造成毒害，因此剧烈建议将溶化的细胞离心后去掉冻存液，然后用新的完全培育基重悬，再接种到新的容器内培育。

8.为什么我的细胞总是污染？如何可以救活污染的细胞？

答：养细胞消失污染，几乎是每个细胞培育技术员简单消失的问题。要防止细胞污染，无非就是保证培育环境无污染，保证所用的全部试剂都无污染源，同时提高操作时的警惕性，这些基本的学问这里就不再废话了。下面讲一讲如何挽救一株已经被污染的细胞株。

（1）体外用抗生素毁灭。一般来说，一旦发觉细胞被微生物污染，应当立刻进行处理，或许还有一线挽救的机会。但是这种挽救不是盲目的，首先应当决断是哪一类生物造成的污染。细胞的污染大致可以分三类：细菌污染、真菌污染和支原体污染。在显微镜下认真观看，这三种微生物污染区分还是比较明显的：假如有大量运动的微生物，且形态较大，轮廓清楚可见，呈较大幅度运动，并且培育基在短时间内变酸，则很可能是细菌污染；假如在显微镜下观看有典型的斑状或丝状微生物（留意与塑料屑、棉花屑和琉璃纤维区分开），基本上看不到明显的运动，则很可能是真菌污染；假如看不到明显的微生物，并且培育基没有明显的颜色上的变化，而细胞状态很差，细胞边缘极其不光滑，而且细胞又莫名其妙地死亡或生长极其缓慢，则有可能为支原体污染，但不能下明确的结论，假如特别需要知道是否为支原体污染可以使用相关的试剂盒进行检测。对于细菌或真菌的污染，可以先把细胞收集起来，用洁净的培育基洗涤离心，交替进行几次，再把洗洁净的细胞放在新的培育板或培育瓶等容器内，加高浓度的抗生素培育，同时剧烈建议加入小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层，以帮助消退微生物。对于细菌污染，可以把青霉素的浓度提高至10倍左右，链霉素浓度提高至5-10倍，也可以用10倍浓度的卡那霉素替代链霉素。对于真菌污染，可以在培育基中加入约5ug/ml的咪康唑（注射用达克宁）抑制。对于这两种状况的污染，采纳上述方法处理后，待细胞稍有好转，并且没有发觉更大规模的污染时，需要尽快重复上面的处理步骤。需要留意的是，此时细胞生长受抗生素的影响比较大故而生长很慢。假如多次传代均未发觉污染复发，可以渐渐降低抗生素浓度直至常规浓度，确定是否完全根除污染。最好进行一次有限稀释的亚克隆操作，以获得更加纯洁的细胞株。而对于支原体污染，则比较麻烦，一般的抗生素是很难解决的，对于轻度的污染，可以试试使用60ug/ml的泰乐菌素和10ug/ml左右的环丙沙星交替处理。假如得到明显的缓解，建议立刻做亚克隆操作，看看是否得到污染根除的细胞株，假如此方法无效，则不能单纯利用抗生素来解决污染问题。

（2）体内法。这个方法很简洁，原理就是动物体有强大的免疫系统，一般的微生物都可以被动物体毁灭。详细操作和制备腹水的方法完全一样，即先用IFA或石蜡制敏小鼠，数天后腹腔注射污染的杂交瘤。假如状况紧急，致敏当天注射杂交瘤也行。一般十天后小鼠产生腹水，在超净台无菌采出腹水，其中即含有大量的杂交瘤细胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射杂交瘤，十几天后可以看到实体瘤形成，也可以在超净台上无菌采摘，然后放回培育板或培育瓶等容器内培育。假如被污染的细胞很少，比如说在96孔板上就被污染了，这时候不能进行腹腔注射，也不要进行皮下注射，否则细胞很简单被老鼠的免疫系统攻击而死亡的，最好的方法是采纳脾内注射的方法进行，同时在腹腔内用IFA或石蜡油致敏，十几天后，同样可以形成腹水，其中即含有洁净的杂交瘤细胞。假如担忧小鼠会受到微生物感染，可以在培育基中先加入高浓度的抗生素，然后连同抗生素一起注射到小鼠体内。

假如确定细胞污染极其严峻，并且细胞已大面积死亡，建议放弃，快速做好环境清洁工作，对细胞操作间作彻底消毒，重新做融合而获得新的细胞株，不行因小失大造成其它的细胞也被污染。

9.为什么我的杂交瘤细胞不能制备腹水或者制备的腹水中没的抗体或腹水没有效价？

答：不能制备腹水的缘由大部份是人为的缘由：

（1）致敏不正确，例如使用了不正确的致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久。

（2）杂交瘤的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。

（3）接种的杂交瘤细胞数量太少或者细胞状态不好。一般不应少于10万个细胞，建议在100万个细胞左右为宜。

（4）制备腹水小鼠的种系与参加融合的细胞来源的动物种系相差太远，以至制备腹水的小鼠对杂交瘤有强大的免疫反应将其杀死，建议更换小鼠品系重新接种。

对于腹水没有效价，可能的缘由：

（1）制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌力量或者打到腹腔内就失去了分泌力量。

（2）致敏小鼠时采纳了错误的致敏剂，如使用了弗氏完全佐剂，这时即使不打杂交瘤，小鼠也会产生腹水。

（3)极其罕见的状况，就是此杂交瘤生产的抗体可以与小鼠体内的分子相互作用，于是杂交瘤产生的抗体被小鼠的相关蛋白中和，这种状况下，小鼠的身体可能会消失明显的特别。

（4）检测腹水效价的试验方案有问题，或者腹水稀释比过大。

10.免疫失败的可能缘由及应实行的措施

答：有时不能获得满足的抗血清，可从下列几方面找缘由，并改进之。

（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑转变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑转变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

（6）动物的饲养是否得当，如养分（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康状况是否良好等。

11.制备单克隆抗体影响因素、失败缘由分析

答：由于制备McAb的试验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不留意就会造成失败。其主要失败缘由和影响因素有：

（1）污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发觉有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培育环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、试验室工作人