2023年质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；.学习并掌握紫外吸取检测DNA浓度和纯度的原理和方法；.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、实验原理1.PCR（多聚酶链式反映）在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等环节，在体外（缓冲液中）复制DNA,使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反映环节为：A.变性:加热反映系统至95°C,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链。B.退火:逐渐减少溶液温度，使合成引物在低温（35—70°C,一般低于模板Tm值的5℃左右）,与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反映温度升至中温72℃,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2.质粒DNA的提取与制备.碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性;B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。.离心层析柱:A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法)：A.物质在光的照射下会产生对光的吸取效应，且其对光的吸取是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸取光谱：DNA分对波长26Onm的紫外光有特异的吸取峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸取峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸取峰C.A260/A280及A260/A23()的比值可以反映DNA的纯度；A260/A280=1.8DNA纯净A260/A280<1.8表达样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质A260/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。.质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶辨认序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应:不同的DNA,分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：(-)实验材料：1.PCR仪器:PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)]＞无菌去离子水、2XPremixTaq、引物.质粒DNA的提取与制备仪器:恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液Pl(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(E1uent).含pMD19—T质粒的大肠杆菌DH5a.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料•：蒸储水、质粒DNA.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10xM酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/u1)、EcoRI(12U/ul).琼脂糖凝胶电泳仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview.TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液(-)实验方法1.PCR准备目的DNA：菌液煮沸lOmin,冷冻，室温解冻后离心取上清液MX0.2mlPCR反映管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水2*PremixTaql2.5ul>引物1(10mol/L)1口1、弓I物2(10mol/L)Iql、菌液5山将PCR反映管置台式离心机中瞬时离心将装有PCR反映体系的PCR反映管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃——30秒,50℃——30秒,72℃——1分钟。循环为30次③72℃5分钟④4℃保温<将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中.质粒DNA的提取与制备取1.5ml培养物加入Eppendorf管中13000rpmxImin,弃上清加入250U1溶液S1,吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮加入250口1溶液S2,颠倒4〜6次混匀(不要剧烈振荡)，直到溶液变得清亮

0加入350山溶液S3,立即温和混匀6〜8次。13000rpm离心lOmin,小心取上清液(5OO-8OOgl)口；将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min,弃滤液,口、加入50()|11去蛋白液(W1),13()()0rpm离心1min,弃滤液

0/_-、向吸附柱中加入700|il漂洗液W2,13000rpm离心Imin,弃滤液；反复一遍乂_J口二空柱13000rpm离心Imin,然后室温放置3min,使残留乙醇挥发.。、取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50pI洗脱缓冲液(Eluent),室温放置Imin,13000rpm离心Imin洗脱质粒DNA,-20℃保存备用

\/.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)/\清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿加入适量的蒸馀水刷洗，2~3次。并用滤纸擦拭干净

\/空白对照比色测定向比色皿加入98ul蒸储水，进行Blank调零SZ,、再向比色皿加入2ul的质粒DNA,于紫外分光光度计上进行'sample'测定，记录相关数据.质粒DNA的酶切鉴定，一在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂无菌水9.0m、10xM旃切缓冲液2.0篦、质粒DNA7.0W、HindIII(15U/ul)l.OghEcoRI(12U/ul)l.Oglx口TOC\o"1-5"\h\z小心混匀试剂，将EP管置于恒温水浴箱中37℃1.5小时。

X.y.琼脂糖凝胶电泳ZX取质粒DNA、经酶切反映后的DNA片段和PCR扩增的DNA各6Hl于三个EP管中并做好标记

\z.」、往每个EP管中加入1uIGelview染料，室温放置一分钟,口、用微量加样枪分别各吸取10ul,按序号加入到电泳仪的凝胶孔中电泳30分钟U、1―-、取出凝胶口紫外光下观测，拍照四、结果与讨论:(一)实验现象.加入溶液p1,出现悬浮现象;.加入溶液P2,温和混匀，溶液会变得清亮；.加入溶液P3,有白色絮状沉淀生成；.电泳时，可观测到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度不同。在紫外检测仪条件下，可以观测到不同的物质出现不同的电泳带。（二）实验结果原始实验数据测量次数0）质粒DNA浓度(ug/ml)Ratio比值(A260/A2811481.4621061.5231151.45平均值1231.47电泳后的图片A：PCR目的条带B：酶切片段C：质粒DNAABC一—一—一一（四）实验分析.由上数据可知，Ratio=l.47A260/A28O<1.8表白样品中具有较多的蛋白质（芳香族）.在图片中，其他三类DNA与Maker相比较，可知质粒DNA的分子大小在2500bp-3500bp,酶切反映的质粒DNA片段分子大小在2800—3000bp和400-500左右，PCR的DNA分子大小在400—500bp0基本符合预期。（四）实验讨论.质粒DNA中出现三条带，分别相应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，另一方面为线性分子,最慢的为开环状分子,所以条带从上到下分别为:超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。，.对于实验结果中：A260/A280VL8的也许因素为：A.在质粒DNA的提取实验的“取上清液”环节中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质，进而导致后续实验中因蛋白质量较多而难以去除。.也许为试剂污染引起杂质蛋白的引入。.实验中需注意的事项：用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不用换吸头，每次换不同试剂时要记得换一个新吸头。在PCR中，假如配好的反映液较多沾到管壁上，要将PCR反映管置台式离心机中瞬时离心，使反映液集中于管底,然后才将反映管放到基因扩增仪上。在质粒DNA提取的实验中，加入溶液S2时，时间不能太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次。在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。在电泳中,Geldview有毒，切勿用手接触。思考题:(1)碱裂解法提取质粒时，溶液I、11、III的作用分别为？答：溶液I：螯合金属离子，克制脱氧核酸酶对DNA的降解作用;有助于溶酶体的作用。溶液H:细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液IIL酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀,Na+可中和DNA。(2)结