彗星试验和斑马鱼胚胎发育试验检测饮用水源水的生物毒性

彗星试验和斑马鱼胚胎发育试验检测饮用水源水的生物毒性摘要：应用人外周血淋巴细胞彗星试验，小鼠睾丸细胞彗星试验以及斑马鱼胚胎发育试验，对苏南地区代表性饮用水源水的生物毒性进行了检测。彗星试验的结果表明，各水样中有机浓集物均能对人外周血淋巴细胞和小鼠睾丸细胞产生不同程度的DNA损伤。斑马鱼胚胎试验的结果表明，在所设剂量范围内，各水样均能对斑马鱼胚胎发育产生不同程度的影响。研究表明上述三种试验方法可有效地检测水中有机污染物的生物毒性。关键词：饮用水，有机污染物，彗星试验，人外周血淋巴细胞，小鼠睾丸细胞，斑马鱼胚胎发育试验ToxicityevaluationofdrinkingwatersourcesusingthecometassayandthezebrafishembryotestAbstract：Inthisstudy,thetoxicpotentialsoforganicpollutantsinsomerepresentativedrinkingwatersourcesofJiangsuProvincewereinvestigatedusingthecometassay(inhumanperipheralbloodlymphocytesandmousetesticularcells)andthezebrafishembryotest.TheresultsofthecometassayshowedthatDNAdamagesinhumanlymphocytesandmousetesticularcellswereinducedafterexposuretotheorganicextractsfromthewatersamples.Andthewatersamplescouldaffectthedevelopmentofzebrafishembryoalso.Theresultsofthisstudydemonstratethatallthesetestscanbesuccessfullyappliedtothetoxicitymonitoringprogramofdrinkingwatersources.Keywords：Drinkingwater，Organicpollutant，Cometassay，Humanperipheralbloodlymphocyte，Mousetesticularcell，Zebrafishembryotest饮用水与人体健康直接相关。自从70年代初美国环保局首次在水中发现氯的衍生物以来，水中有机物对人体健康的影响已日益引起人们关注[1]。由于此类有机物大都呈现低剂量长期暴露的特点，常规的理化分析不足以对水质状况作全面的评价，因此，有必要建立一种有效的测试方法评价水中有机物的对生物，特别是对人的毒性，以准确直观地反映水体对人体健康的潜在危害。 彗星试验是一种快速、简便、灵敏的检测单个细胞DNA断裂的技术，近年来由于其诸多优点正越来越多地在环境监测方面得到广泛的应用[2]。与传统鱼类急性毒性试验相比，斑马鱼胚胎发育试验由于其成本低、影响因素少，敏感度高等优点，大有取代前者的可能，同时其不同发育阶段可为化合物毒理学研究提供特殊的信息，使其在分析综合污水中的毒性物质、毒物作用机理方面具有独特的优势[3]。本文采用人外周血淋巴细胞彗星试验、小鼠睾丸细胞彗星试验以及斑马鱼胚胎发育试验，研究了不同水样的生物毒性，有助于为水体安全监测提供有效的测试方法和指标。材料和方法1.1试验材料健康人外周肝素抗凝全血，采自南京市中心血库。昆明种雄性小鼠，体重30克左右，由南京大学生命科学院动物房提供。常规喂养，观察一周后，健康者供试验用。斑马鱼，购于南京市花鸟市场。饲养产卵鱼于玻璃缸内，光周期为12hr/12hr，雌雄比例为1：2，水温26±1℃，DO>7mg/L，饲料为干饲料和红虫。试验用水为标准稀释水。1.2水样的采集与处理于2003年12月采集无锡小湾里水源厂源水，常州西石桥水厂源水及长荡湖湖心水样。其中，无锡小湾里水源厂水源地为太湖梅梁湾，常州西石桥水厂水源地为长江，长荡湖为常州金坛市拟用水源地。各采样点采样量均为100L。水样静置24hr，过滤去除悬浮颗粒，通过XAD-2树脂吸附柱富集，控制流速在30-40mL/min，N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷洗脱，洗脱液用氮吹仪在50℃条件下浓缩，吹干，再用二甲基亚砜（DMSO）溶解，定容至2.0mL，避光保存于-18℃冰箱中备用。1.3彗星试验1.3.1人外周血淋巴细胞彗星试验1.3.1.1人外周血淋巴细胞分离和染毒明胶法分离淋巴细胞并分装于微量离心管中，加PBS0.9mL及水样浓集物0.1mL，37℃染毒1hr。每个水样设三个剂量（即相当于原水样20mL、100mL、500mL/管）。染毒后离心弃上清，沉积细胞置4℃冰箱中备用。同时作DMSO溶剂对照。用苔盼蓝染色观察细胞存活率（>90%）。1.3.1.2彗星试验及结果评价彗星试验方法参见Singh报道[4]。铺好胶层的玻片在冷细胞裂解液裂解1hr后，在碱性电泳液（pH＝13.0）静置，解旋30min。调节电压为25V，电流为100mA，电泳1hr。以上各步骤应在红光或黄光下进行，以免产生额外的DNA损伤。电泳后，经中性缓冲液中和，在24hr内，每张玻片以50µL溴乙锭（EB）染色，荧光显微镜下观察并进行损伤评价。一个典型彗星包括头部和尾部，不同程度损伤根据可见荧光的尾部与其可见头部的比例大小而分为0，1，2，3，4五个等级。每张玻片观察100个左右细胞，计算细胞损伤专用单位（Arbitraryunits），方法如下：Arbitraryunits＝×Ni，其中i：损伤等级(0,1,2,3,4)；Ni：i级的细胞数[5]。采用SPSS软件，以单因素方差分析（ANOVA）比较各剂量组与溶剂对照间的损伤差异。考虑到高剂量的染毒可能造成DNA的严重损伤，从而使大量的DNA游离断片在电泳过程中丢失而引起可测DNA损伤的降低[6]，而剂量过低可能使组间差异难以充分表现，所以本文以100mL/管这一剂量对各水样间的遗传毒性进行多重比较。组间的多重比较采用Duncan检验法，显著性水平为0.05。1.3.2小鼠睾丸细胞彗星试验1.3.2.1小鼠睾丸细胞分离和染毒小鼠睾丸细胞分离参考张遵真[7]的方法。将制得的睾丸细胞分装于微量离心管，加DMEM0.9mL及水样浓集物0.1mL，34℃染毒1hr。剂量设定同人血淋巴细胞彗星试验。染毒后离心，沉积细胞置4℃冰箱中备用。同时作DMSO溶剂对照。铺胶前用苔盼蓝染色观察细胞存活率（>90%）。1.3.2.2彗星试验及结果评价同人血淋巴细胞彗星试验。1.4斑马鱼（Daniorerio）胚胎发育试验1.4.1斑马鱼受精卵的收集和染毒受精卵的收集和染毒参照OECD的操作指南[8]。选用24孔培养皿，每孔加入2mL水样浓集物，放一枚受精卵。每张多孔板为一个实验浓度组，其中4个孔以曝气稀释水作为组内对照。每个水样设5个剂量组，同时设空白对照。试验中作为溶剂的DMSO浓度不高于0.25％。将多孔培养皿放置在恒温光照培养箱中孵化，培养条件为26±1℃，光照周期12hr/12hr。各水样每个剂量组至少作3个平行。1.4.2观察及结果评价定时在倒置显微镜下观察，并记录胚胎发育情况。以斑马鱼胚胎96hr能否正常孵化为毒理学终点，各水样各剂量组与空白水样间的差异以χ2进行显著检验。试验结果2.1彗星试验2.1.1人外周血淋巴细胞彗星试验 各水样中有机浓集物对人外周血淋巴细胞彗星试验的结果见表1。从表中可以看出，从表中可以看出，各水样浓集物均能引起不同程度的DNA损伤，与溶剂对照相比均有极显著差异(P<0.01)。随着剂量的加大，DNA受损的程度也加重。以100mL/管这一剂量组进行多重比较表明，对人血淋巴细胞DNA损伤程度为小湾里水源厂源水、金坛长荡湖湖心水样>常州西石桥水厂进水。表1西石桥水厂进水、长荡湖湖心水样和小湾里水源厂进水（2003.12）有机浓集物对人外周血淋巴细胞DNA的损伤水样染毒剂量（mL//管）细胞损伤分级（％％）DNA损伤专用单单位（AU）01234西石桥水厂进水2010.07±100.1876.74±8..4713.20±8..6300103.13±116.87***100066.44±133.3831.43±133.182.13±1.0070135.69±113.64***a500033.75±9..8454.87±122.2810.21±7..381.17±1.443178.80±112.85***长荡湖湖中心2029.56±4..7949.18±2..1421.25±3..730091.69±8..32**100037.34±122.3746.46±100.3616.04±4..040.16±0.335179.01±115.48***b500014.54±6..8640.68±7..3941.32±5..163.46±1.550233.71±99.39***无锡小湾里水源厂厂进水200.74±1.22786.61±1..9111.68±0..170.97±0.6690112.89±00.66***100042.06±6..1934.93±8..1720.00±2..363.01±1.330183.95±55.57***b50001.61±1.22151.84±3..4041.35±4..585.20±1.881250.14±11.95***溶剂对照073.02±3..2025.67±3..161.30±0.7700028.28±3..39注：1.数据以meean±SDD表示，*：P<0.005,***:P<0.01;;2.以100mmL/管进行多重重比较，相同同字母表示无无差异，显著著性水平为0.05。2.1.2小鼠睾丸细胞彗星试验表2西石桥水厂进水、长荡湖湖心水样以及小湾里水源厂进水（2003.12）有机浓集物对小鼠睾丸细胞DNA的损伤水样染毒剂量（mL//管）细胞损伤分级（％％）DNA损伤专用单单位（AU）01234西石桥水厂进水2036.44±5..4451.87±5..8111.69±1..880075.26±5..71**1001.91±1.33152.94±6..4541.33±4..033.82±2.5530147.05±66.26***a500013.10±3..7843.39±2..1938.89±6..504.61±2.554253.00±88.47***长荡湖湖心2025.93±1..7545.02±6..0228.24±6..320.80±0.7760103.91±88.43***1005.56±1.77917.24±2..5737.16±7..2737.14±3..872.91±1.554214.61±55.89***b500－－－－－－小湾里水源厂进水水2015.34±1..6448.70±2..5235.56±3..500.40±0.5500121.03±44.76***100016.93±3..1939.38±3..5536.20±4..027.49±1.223234.25±55.09***c500－－－－－－溶剂对照051.74±5..2547.53±5..020.74±1.2270049.00±5..76注：1.数据以meean±SDD表示，*：P<0.005,***:P<0.01;;2.以100mmL/管进行多重重比较，相同同字母表示无无差异，显著著性水平为0.05。各水样中有机浓集物对小鼠睾丸细胞彗星试验的结果见表2。其中长荡湖湖心、小湾里水源厂进水高剂量组（500mL/管）对DNA损伤极高而难以准确计算，故不列出。从表中可以看出，各水样浓集物均能引起小鼠睾丸细胞不同程度的DNA损伤，与溶剂对照相比均有极显著差异(P<0.01)。随着剂量的加大，DNA受损的程度也加重。以100mL/管这一剂量组进行多重比较表明，对小鼠睾丸细胞DNA损伤程度小湾里水源厂源水>金坛长荡湖湖心水样>常州西石桥水厂进水。2.2斑马鱼胚胎发育试验试验结果见表3。从表3中可以看出，与空白对照相比，常州西石桥水厂进水、金坛长荡湖湖心水样和无锡小湾里水源厂进水分别在浓缩倍数125、62.5和7.812时能对斑马鱼胚胎96hr正常孵化率产生极显著影响（P<0.01）。所以，各水样有机物对斑马鱼胚胎的影响程度为无锡小湾里水源厂进水>金坛长荡湖湖心水样>常州西石桥水厂进水。表3小湾里进水、长荡湖湖心、西石桥水厂进水水样各剂量组对斑马鱼胚胎96h正常孵化率（％）的影响剂量（浓缩倍数）7.812515.62531.2562.5125小湾里进水66.67±6..24**65.00±7..07**36.67±6..24**0.00**0.00**长荡湖湖心93.33±4..7185.00±7..0781.67±100.270.00**0.00**西石桥进水85.00±144.7278.33±6..2478.33±111.7990.00±4..0838.33±288.96***空白对照87.73±9..03注：孵化率（％）以mean±SD表示；**:P<0.013讨论根据2002江苏省环境状况公报，长江江苏段干流水质总体较好，水质符合地表水环境质量II类标准。太湖湖体水质总体劣于Ⅴ类。长荡湖为太湖流域第三大湖泊，目前水质基本满足Ⅲ类标准，且近年来在逐渐变差。从本研究可以看出，彗星试验（包括人外周血淋巴细胞和小鼠睾丸细胞）和斑马鱼胚胎发育试验的试验结果均与各水源地的水质状况基本一致，证明上述三种试验方法可有效地检测水中有机污染物的生物毒性。自1988年Singh提出碱性电泳法以来，各国对彗星试验的应用研究几乎呈指数式增长，在遗传毒性研究、临床应用、DNA修复研究、环境生物监测、人群监测等领域得到广泛应用[9]。人血淋巴细胞是彗星试验最常用的生物材料之一，应用也最为广泛。Rajaguru等将人血淋巴彗星试验应用于受污染地表水的检测，表明其在环境评价中有良好的应用前景[10]。本实验室曾利用其评价扬中市地表水的污染状况[11]。本研究表明，各水样有机浓集物对人血淋巴细胞存在遗传毒性。研究有机污染物对小鼠的毒性可以很好地反映其对哺乳动物，特别是对人的危害状况，从而及时地预报对人类的危害。同时，研究发现生殖细胞DNA的损伤可导致染色体异常、流产、畸形、遗传病以及下一代对癌症易感性的增加等[12]。而小鼠睾丸细胞易于分离，且具有一定的代谢活性作用，适于评价化合物对生殖细胞的遗传毒性[7]。有研究表明，睾丸是有机污染物的作用靶器官，有机提取物可通过血—睾屏障。光镜观察显示有机污染物对染色质有损害[13]。本研究也表明饮用水源水中存在的有机污染物能对小鼠睾丸细胞DNA产生损害作用，存在遗传毒性。同时，在其中两个水样高浓度组DNA损伤极为严重，甚至出现了彗星头、尾部分离的情况，这表明水样中污染物可能已引起睾丸细胞的凋亡，存在细胞毒性。研究也表明，与人血淋巴细胞相比，有机浓集物对小鼠睾丸细胞造成的DNA损伤更为严重。这可能是因为睾丸细胞DNA比人血淋巴细胞DNA对有机物更为敏感。吴坤等应用小鼠整体试验对自来水中有机污染物潜在危害进行评价时发现生殖细胞比体细胞更为敏感[14]。另一方面，彗星试验结果显示对照组细胞DNA存在着较大损伤（相对于人血淋巴细胞彗星试验而言），这可能也是造成其各水样各剂量组其DNA损伤更为严重的原因，所以有必要改进小鼠睾丸细胞的分离和培养方法。在斑马鱼胚胎发育试验中，毒理学终点的选择主要考虑以下方面：可衡量、毒理学上明显，以及操作的简易性。试验中我们选用96hr能否正常孵化作为毒理学终点。同时，在试验中我们观察到多种不同的发育异常，如与致死性相关的卵凝结、发育停止等，以及致畸性相关的如体轴的畸形、卵黄囊吸收迟缓和多种水肿等。这其中，在小湾里进水和长荡湖湖心水样的高剂量组，发育异常胚胎多数在心脏和卵黄囊部位有明显水肿。一般而言，致畸性毒理学终点比致死终点更为敏感，有研究表明，Europeanminnow在毒作用下也显出相似的毒理学终点[15]。因此，脊椎变形、卵黄囊吸收迟缓和水肿的形成可作为鱼类早期阶段对毒物的非特异性反应，值得进一步研究。在毒物暴露过程中，胚胎的卵膜具有重要作用。卵膜随发育时间的改变以及毒物性质的不同其通透性也有较大的变化，同时考虑到胚胎的代谢系统没有发育完全，所以毒物和酶系统的相互作用在实验中难以完全体现。在发育生物学和分子遗传学领域，应用斑马鱼胚胎已有大量研究成果发表，对探讨污染物的致毒机理很有帮助。这一优势特别有助于测定混合性工业污水的毒性，具有广阔的发展空间。目前，发达国家还是把主要注意力放在测定新化学品的毒性方面，在污水方面的工作尚在尝试阶段，而且发展较慢。Strmac等[15],Gellert和Heinrichsdorff[16]的研究都表明斑马鱼胚胎发育试验是合适的毒性监测手段。而解决各种工业废水和生活污水所造成的环境问题已经成为我国环保事业的当务之急。本研究证明，斑马鱼胚胎发育试验可用于对饮用水源有机物污染的监测。参考文献：朱惠刚.水中有机致突变物综合评价指标探讨.上海环境科学，1995,14(10):44-49RojasE，LopezMC，ValverdeM.Singlecellgelelectrophoresisassay:methodologyandapplications.JChromatogrB,1999,722:225–254朱琳，史淑洁.斑马鱼胚胎发育技术在毒性评价中的应用.应用生态学报，2002，13（2）：252-254SinghNP,McCoyMT,TiceRR,etal.AsimpletechniqueforquantitationoflowlevelsofDNAdamageinindividualcells.ExpCellRes,1988,175:184-191CollinsAR,MaAG,DuthieSJ.ThekineticsofrepairofoxidativeDNAdamage(strandbreaksandoxidisedpyrimidines)inhumancells.MutatRes,1995,336:69-77DevauxA,PesonenM,MonodG.Alkalinecometassayinrainbowtrouthepatocytes.ToxicolinVitro,1997,11:71~79张遵真，衡正昌，廖艳等．彗星试验检测间接诱变剂对小鼠睾丸细胞的DNA损伤.癌变·畸变·突变,2001,13(1):4-7OECD.Fish,short-termtoxicitytestonembryoandsac-frystages.OECDGuidelineforTestingofChemicals,OECDTG212,Paris,1998TiceRR，AgurellE，AndersonD,etal.Singlecellgel/cometassay:guidelinesforinvitroandinvivogenetictoxicologytesting.EnvironMolMutag,2000,35:206–221RajaguruP,VidyaL,BaskarasethupathiB,etal.Genotoxicityevaluationofpollu