发酵学工业微生物的菌种选育

发酵学工业微生物的菌种选育第一页，共八十八页，2022年，8月28日第一节概述第二节自然选育第三节诱变育种第四节杂交育种第二页，共八十八页，2022年，8月28日第一节概述一、工业微生物二、发酵工业对菌种的要求三、菌种选育的目的四、菌种选育的基本理论五、菌种来源第三页，共八十八页，2022年，8月28日1.细菌第一节概述一、工业微生物第四页，共八十八页，2022年，8月28日第五页，共八十八页，2022年，8月28日链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌

抗生素中60%以上由放线菌产生，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。生产多种抗生素2.放线菌（单细胞原核微生物）第六页，共八十八页，2022年，8月28日

酵母菌是一群单细胞的真核微生物,其形态因种而异.通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、腊肠形，假菌丝等。3.酵母菌第七页，共八十八页，2022年，8月28日第八页，共八十八页，2022年，8月28日许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。4.藻类第九页，共八十八页，2022年，8月28日二、发酵工业对菌种的要求1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，代谢产物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：发酵条件易控制，菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途径尽可能地简单），产品易分离3.稳定性：抗杂菌和抗噬菌体能力强，遗传性状稳定，菌种不易变异退化4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素第一节概述第十页，共八十八页，2022年，8月28日三、菌种选育的目的1、提高发酵产量2、改进菌种的性能3、产生新的发酵产物4、去除多余的组分第一节概述第十一页，共八十八页，2022年，8月28日（一）菌种选育的理论基础（二）突变诱发的过程四、菌种选育的基本理论第一节概述第十二页，共八十八页，2022年，8月28日（一）菌种选育的理论基础遗传和变异

基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。第十三页，共八十八页，2022年，8月28日前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。影响前突变产生的的因素细胞对诱变剂的透性细胞质和酶的影响基因所处的状态1、前突变形成（二）突变诱发的过程第十四页，共八十八页，2022年，8月28日

1）光复活作用

2）切补修复

3）重组修复

4）SOS修复系统（多数诱变来源于此）

5）DNA多聚酶的校正作用2、DNA损伤的修复（二）突变诱发的过程第十五页，共八十八页，2022年，8月28日（二）突变诱发的过程第十六页，共八十八页，2022年，8月28日（二）突变诱发的过程第十七页，共八十八页，2022年，8月28日SOS修复系统

它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。

（二）突变诱发的过程第十八页，共八十八页，2022年，8月28日校正差错：光复活作用、切补修复引起差错：重组修复、SOS修复系统。3、从前突变到突变（二）突变诱发的过程第十九页，共八十八页，2022年，8月28日表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变分离型迟延(基因杂合)经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。生理性迟延

新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。4、从突变到突变型（二）突变诱发的过程第二十页，共八十八页，2022年，8月28日从菌种保藏中心购买育种从自然界中筛选诱变杂交育种基因工程育种

四、菌种来源第一节概述第二十一页，共八十八页，2022年，8月28日source1第二十二页，共八十八页，2022年，8月28日第二十三页，共八十八页，2022年，8月28日国际承认的中国培养物保藏单位

武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC。保藏了几乎所有的培养物。中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC。保藏有普通菌种。(CGMCC)中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM——管理机构

第二十四页，共八十八页，2022年，8月28日第二十五页，共八十八页，2022年，8月28日订购程序申请生物安全性说明确认订货第二十六页，共八十八页，2022年，8月28日一、定义二、方法三、特点及应用第二节自然选育第二十七页，共八十八页，2022年，8月28日自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一、定义多因素低剂量的诱变效应互变异构效应第二节自然选育第二十八页，共八十八页，2022年，8月28日二、菌种自然选育方法单菌落分离法菌种单细胞悬液琼脂板分离挑取单菌落测定生产能力细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤第二节自然选育第二十九页，共八十八页，2022年，8月28日第三十页，共八十八页，2022年，8月28日用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株

羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选检定菌培养，加上发酵液

这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。第三十一页，共八十八页，2022年，8月28日三、特点及应用简单易行、自发突变的效率低。纯化菌种，防止菌种衰退、稳定产量和提高产量第二节自然选育第三十二页，共八十八页，2022年，8月28日1、目前生产用菌种的特点多为人工诱变而来。代谢调控系统失控。生活力比野生菌株弱。容易发生变异。菌种衰退原因的分析第三十三页，共八十八页，2022年，8月28日2、菌种遗传特性的改变1）异核现象--导致菌种这一微生物群体发生变异2）自发突变3）回复突变或产生分离子--形成具有不同基因型的个体异核体孢子遗传特性和生长速度不同菌种遗传特性发生改变相邻菌丝细胞吻合回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回复突变。第三十四页，共八十八页，2022年，8月28日1）一个菌种不是纯一的群体。3、菌种生理状态的改变2）培养基营养成分的影响3）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同，使得菌种的生理状态不同。主要是因为培养条件不适当。第三十五页，共八十八页，2022年，8月28日一、定义及特点二、诱变剂三、诱变育种的主要环节第三节诱变育种第三十六页，共八十八页，2022年，8月28日第三节诱变育种诱变育种：通过诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出具有优良特性的变异菌株的方法。特点：速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。一、定义及特点第三十七页，共八十八页，2022年，8月28日生物诱变剂化学诱变剂物理诱变剂紫外线快中子NTG亚硝酸烷化剂噬菌体转座子烷化剂是重要的诱变剂，带有活性烷基，通过烷化磷酸基、碱基与DNA作用。第三节诱变育种二、诱变剂第三十八页，共八十八页，2022年，8月28日第三节诱变育种突变的诱发↓突变株的筛选↓突变高产基因的表现第三十九页，共八十八页，2022年，8月28日1.出发菌株的选择2.诱变处理

举例3.筛选4.突变菌株高产基因的表达第三节诱变育种三、诱变育种的主要环节第四十页，共八十八页，2022年，8月28日选择纯种菌株（排除异核体）优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）对诱变剂敏感的菌株同时选择几株不同的优良菌株1.出发菌株的选择第四十一页，共八十八页，2022年，8月28日1）诱变剂的选择碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中甲基磺酸乙酯常被称为”超诱变剂”，是毒性最小的诱变剂之一。紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的突变。但它可能影响邻近基因的性能。2.诱变处理第四十二页，共八十八页，2022年，8月28日2）选择原则不稳定菌株→温和的、常用的诱变剂；稳定菌株→强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂不经常使用一种诱变剂，也不宜频繁更换。注意考虑诱变剂本身的特点。

UV→DNA的嘧啶碱基；亚硝酸→嘌呤碱基第四十三页，共八十八页，2022年，8月28日高剂量：致死率90%-99.9%变异幅度大，但负变株多低剂量：致死率75%-80%负变株少，且突变菌株稳定3）诱变剂量的选择第四十四页，共八十八页，2022年，8月28日4）影响诱变效果的因素（1）菌种的生理状态

碱基类似物、亚硝基胍→分裂中的DNAUV、亚硝酸、烷化剂、电离辐射→都有效。

（2）辅助剂

核酸碱基、氯霉素、氨基酸、氯化锂、重金属离子等

（3）温度、氧、pH值、可见光等第四十五页，共八十八页，2022年，8月28日诱变的有效波长是253-265nm。诱变效果由紫外强度、距离和照射时间决定可见光能够激活光复活酶，将紫外诱变的DNA修复。举例（紫外线育种）第四十六页，共八十八页，2022年，8月28日紫外诱变机理DNA对紫外线有强烈的吸收作用，引起结构的变化形成嘧啶二聚体，破坏腺嘌呤的正常掺入和碱基的正常配对。链间二聚体阻碍双链解开。第四十七页，共八十八页，2022年，8月28日制备菌悬液细菌要处于对数生长期，此时，生长状态同步，生理活性一致，细胞浓度较高。霉菌、放线菌要用孢子。保证菌悬液均匀用玻璃珠振荡，使细胞均匀分散。维持一定的细胞浓度真菌和酵母一般是106-107个/毫升，放线菌和细菌是108个/毫升。紫外诱变步骤第四十八页，共八十八页，2022年，8月28日培养达到要求时间后，盖上培养皿盖，在红外灯下稀释分离，涂平板，用黑布包扎，在适当温度下培养。第四十九页，共八十八页，2022年，8月28日功率为15W的紫外灯照射距离：30cm照射时间：几秒~10min处理过程应在暗室的红光下操作（why?）诱变：单细胞悬液放置于培养皿中，放入无菌搅拌子。将培养皿置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器和培养皿盖，打开紫外灯，计时。培养：达到要求时间后，盖上培养皿盖，在红外灯下稀释分离，涂平板，用黑布包扎，在适当温度下培养。第五十页，共八十八页，2022年，8月28日3.筛选根据步骤可以分为初筛和复筛初筛量大，条件粗放。一个菌种进一个摇瓶。复筛条件要求应逐步提高。每个菌株进3~5个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复筛选几次。注意亲株作对照。复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件第五十一页，共八十八页，2022年，8月28日根据操作方法可分为随机筛选和理性化筛选

随机筛选

理性化筛选运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和分子结构来进行设计和采用一些筛选方法。从而打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，筛选高产菌株第五十二页，共八十八页，2022年，8月28日

1）摇瓶筛选法

单菌落→传种斜面→模拟发酵瓶→测定发酵能力

2）琼脂块筛选法

打孔取块→鉴定平板测定发酵能力→(须经摇瓶复筛)随机筛选第五十三页，共八十八页，2022年，8月28日3）筛选自动化和筛选工具微型化随机筛选第五十四页，共八十八页，2022年，8月28日96孔板高通量孵育筛选随机筛选第五十五页，共八十八页，2022年，8月28日1.初级代谢产物高产菌株的筛选

①筛选营养缺陷型理性化筛选第五十六页，共八十八页，2022年，8月28日理性化筛选第五十七页，共八十八页，2022年，8月28日②筛选细胞膜透性改变的突变株使之大量分泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。谷氨酸棒杆菌生物素营养缺陷型细胞膜通透性谷氨酸分泌至胞外理性化筛选第五十八页，共八十八页，2022年，8月28日③筛选结构类似物抗性突变株用与代谢产物结构类似的化合物处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大多数细胞，选出能产生该代谢物的抗反馈突变株。理性化筛选第五十九页，共八十八页，2022年，8月28日2.次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选

(1)利用营养缺陷型筛选（渗漏缺陷型）

渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量的生长理性化筛选第六十页，共八十八页，2022年，8月28日(2)筛选负变株的回复突变株选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常的突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选高产菌株。理性化筛选第六十一页，共八十八页，2022年，8月28日

(3)筛选去磷酸盐调节突变株

①能在磷酸盐抑制浓度下，正常合成抗生素的突变株②磷酸盐结构类似物(砷酸盐、钒酸盐)抗性突变株

(4)筛选去碳源分解代谢调节突变株

能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素。筛选去碳源分解代谢调节突变株，可提高抗生素发酵产量，简化生产工艺。理性化筛选第六十二页，共八十八页，2022年，8月28日＊筛选出赖氨酸类似物抗性株→(5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株

＊半光氨酸、缬氨酸→青霉素前体→青霉素理性化筛选第六十三页，共八十八页，2022年，8月28日(6)筛选二价金属离子抗性突变株(7)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株①不能合成或很少合成的前体

苯乙酸和苯氧乙酸（有毒性）→青霉素侧链前体②能合成但不能大量累积的中间产物

丙酸（干扰初级代谢中间产物）→红霉素③初级代谢终产物，有反馈作用不能大量累积。

缬氨酸→青霉素(8)筛选自身所产的抗生素抗性突变株理性化筛选第六十四页，共八十八页，2022年，8月28日1、营养缺陷型菌株筛选

所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。补充内容第六十五页，共八十八页，2022年，8月28日1）筛选用培养基⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。补充内容第六十六页，共八十八页，2022年，8月28日2）营养缺陷型菌株筛选的一般方法

（1）诱变剂处理（2）淘汰野生型菌株①抗生素法②菌丝过滤法（3）检出营养缺陷型（4）鉴定营养缺陷型补充内容第六十七页，共八十八页，2022年，8月28日检出营养缺陷型①夹层培养法

②限量补充培养法

③逐个检出法

④

影印接种法补充内容第六十八页，共八十八页，2022年，8月28日影印平板法筛选目的菌第六十九页，共八十八页，2022年，8月28日将突变菌株放到完全致死的环境中，一次性筛出抗性突变株。包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体2、抗性突变株筛选补充内容第七十页，共八十八页，2022年，8月28日培养基发酵条件4.突变菌株高产基因的表达第七十一页，共八十八页，2022年，8月28日一、定义和特点二、原理三、常规的杂交育种：准性生殖方式杂交四、原生质体融合技术第四节杂交育种技术第七十二页，共八十八页，2022年，8月28日杂交育种一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。一、定义和特点定向杂交后对诱变剂敏感—消除诱变效应饱和改变产品质量和产量操作复杂，技术要求高，推广和应用受限特点第七十三页，共八十八页，2022年，8月28日

将两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）。二、原理1.理论基础－基因重组2.重组与杂交的关系重组→分子水平，杂交→细胞水平杂交中必然包含着重组；重组则不限于杂交这一形式。第七十四页，共八十八页，2022年，8月28日

(一)遗传标记

所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。

营养标记菌株（营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。三、常规的杂交育种第七十五页，共八十八页，2022年，8月28日(二)异核体形成第七十六页，共八十八页，2022年，8月28日(三)杂合二倍体的形成*提高异核二倍体的培养温度*用紫外线照射异核体*樟脑蒸汽熏特点：体积、DNA含量明显大于直接亲本；具有较高的酶活性，生长速率和糖的利用率较快。提高异核体形成杂合二倍体的常用方法：第七十七页，共八十八页，2022年，8月28日（四）重组1染色体交换发生在体细胞的有丝分裂过程中。特点：形成的两个子细胞仍为双倍体细胞，但基因型不同。2染色体单倍化第七十八页，共八十八页，2022年，8月28日基因重组甲

生长快、产量低乙生长慢、产量高生长快、产量高应用

第七十九页，共八十八页，2022年，8月28日

面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生CO2多，生长快；

酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱

杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。第八十页，共八十八页，2022年，8月28日四、原生质体融合用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PE