医学分子生物学原理之生物芯片技术

生物芯片技术BiochipTechnology第一节概述一、生物芯片的概念二、DNA芯片一、基因表达谱研究一、原位合成DNA芯片制作二、DNA微阵列芯片制作一、待测样品的准备二、分子杂交反应三、检测分析第二节生物芯片的制作第三节DNA芯片使用的基本流程第四节蛋白质芯片第五节生物芯片的基本操作和流程二、DNA测序三、基因突变检测四、基因诊断五、蛋白质芯片的应用六、药物研发目录*2

生物芯片(biochip)技术是20世纪90年代初，由分子生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而发展起来的高新技术。

生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。

生物芯片将会改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。

因既具有重大的学术价值，又具有明显的产业化前景，被评为1998年度世界十大科技进展之一。DotBlotMacroarrayMicroarraySouthern&NorthernBlot基因芯片发展历史

萨瑟恩提出的核酸杂交理论，即标记的核酸分子能够与被固化的、与之互补配对的核酸分子杂交。（EdwinMellorSouthern）Southern杂交可以被看作是生物芯片的雏形。*5

桑格和吉尔伯特发明了现在广泛使用的DNA测序方法，并由此在1980年获得了诺贝尔奖。（FrederickSanger）（WalterGilbert）生物芯片这个概念首先是由FredSanger和WalterGilbert提出的；解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、低通量等不足。*6

1989，Stephen

Fodor(斯蒂文·弗尔多)发明了高密度生物芯片和芯片阅读器，为生物芯片产业开创及发展奠定了良好的基础。1992，Affymatrix公司Fodor小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。*71995，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片；将cDNA密集点样在玻璃片上，进行基因表达谱研究和SNP分析。*8一、生物芯片的概念

生物芯片是指通过微电子和微加工技术，将大量已知序列的核酸片段或蛋白肽段等作为探针，有序地组合在1cm2大小固相介质表面而构成的集成分析系统；*10第一节概述

可与标记的对应核酸或蛋白分子特异结合，实现对核酸、蛋白等生物组分的快速、高效、敏感的处理与分析。

狭义的生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。

广义的生物芯片还包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片、缩微化的实验室即芯片实验室。根据芯片的用途可分为两大类*11生物芯片的基本原理与特征：“芯片”特征：“分子杂交”原理：生物分子间相互的特异识别和结合（如:DNA分子互补链之间、蛋白分子之间、蛋白分子与DNA分子之间等）。高集成、高通量、并行化,微型化、自动化、连续化*12二、DNA芯片又被称为基因芯片(genechips)、DNA阵列(DNAarray)、cDNA芯片(cDNAchips)、寡核苷酸阵列(oligonucleotidearray)等。

DNA芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面；使用时与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析从而得出样品的遗传信息。*1314DNAMicroarray/GeneChip/DNAChipAAACCTCGTTTCGGGAAAACCTCGTTTCGGGA原位合成芯片(SyntheticGenechip)DNA微阵列(DNAMicroarray）研发小组Affymatrix公司Fodor研究组斯坦福大学Brown实验室制作方式原位化学合成收集探针，显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探针长度短，小于50nt较长，100~500nt

或更长最高集成度10~40万点阵/cm21~10万点阵/cm2专利保护专利控制严格无专利控制（一）根据制作方式可分为两大类：*15

1.玻片型这种芯片的点阵大多是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。*16有此类产品研制能力的公司不多,如Affimetrix公司。（二）从支持物来分主要有：

2.薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如CloneTech公司）。*173.微板型这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板（如PE公司等）。*184.集成电路型将杂交技术与微电子技术结合于一体，通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）*19基因芯片的制作方式原位合成直接点样分子印章法针式点样喷墨点样显微光蚀刻技术(光引导原位合成)分子印章法压电打印法*20第二节生物芯片的制作一、原位合成DNA芯片的制作(一)显微光蚀刻技术支持物经化学处理,

表面活性羟基(OH)连接光敏保护基(X),选用光刻掩模(M1)保护非聚合部位；2.用激光点光源照射聚合部位,去除光敏保护基(X),暴露活性羟基(OH)；

3.加入单核苷酸(如dTMP)的亚磷酰胺活化端与活性羟基(OH)发生化学偶联,光敏保护非活化端；4.更换掩模(M2)，激光点光源照射下一个位点；5.脱保护，偶联第二个核苷酸(如dCMP)；6.重复上述步骤，直至合成完所需探针。*21合成过程光刻掩模1光刻掩模2(一)探针的设计与制备二.DNA微集阵列芯片的制作*23(二)支持物的类型与预处理(三)探针的打印(四)探针的固化*24第三节DNA芯片使用的基本流程1、探针设计与芯片制备2、样品制备与标记3、杂交反应4、信号检测和结果分析实验样本对照样本一、探针的设计与芯片的制作1.探针的设计--寡核苷酸探针设计原则(1)完全互补性：对目的基因或相关序列的保守区而言，PM

探针。(3)探针的丰度：针对靶基因序列设计多个(3个以上)寡核苷

酸探针。(2)高度特异性：对基因家族的某个成员或对不同生物种属

的同一基因而言。(4)单碱基错配：即设计MM(mis-match)探针：作内参照(衡

量探针的特异性)。(5)设阳性对照：采用看家基因β-actin或GADPH基因作为阳性对照。*25离心2.探针的制备cDNA文库

挑取

cDNA克隆

扩增培养(液体培养)PCR扩增扩增产物电泳(鉴定含靶序列的克隆)相应的

PCR产物+

异丙醇打印加DMSO溶解

挥干乙醇70％乙醇洗涤取沉淀*26(1)玻片的清洗4.探针的打印与固化3.玻片的多聚-L-赖氨酸预处理(1)编辑打印程序、探针打印(2)紫外线照射(使探针与玻片交联结合)(3)80℃烘干固定、室温避光保存(2)用多聚-L-赖氨酸处理玻片NaOH乙醇浸泡振荡至少2hr；双蒸水反复漂洗。多聚-L-赖氨酸溶液浸泡振荡15min~1hr；双蒸水反复漂洗；离心、45℃干燥。*27

二、待测样品的制备用PCR或反转录法标记时，可用荧光标记底物(dNTP)，

也可标记引物的5’末端。双色荧光标记：待测样品用Cy3；对照用Cy5。常用于标记的荧光分子有：Cy3、Cy5、FITC、TRITC

和生物素等。组织细胞或其他材料提取核酸纯化纯核酸核酸纯化随机引物延伸、PCR或反转录标记*28特点：探针的数量>>

靶基因的数量反应动力学：呈线性关系信号强度∝

(样品)靶基因的量2.杂交反应条件优化肽核酸(peptidenucleicacid,PNA：以多聚甘氨酸链替代糖-磷酸主链的DNA类似物)分子内无带负电荷的磷酸基团。1.芯片杂交的特点：3.Nanogen公司研制出的电子基因芯片。三、分子杂交反应*29检测芯片荧光信号有两类仪器：1、利用电荷偶合装置检测的摄像仪；激光共聚焦：扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。有效防止来自杂质的荧光信号，提高信/噪比。四、检测分析*302、激光共聚焦扫描仪。(入射)激光束发射光滤镜检测透镜检测器共聚焦针孔荧光束光束分离器(分光镜)物镜支持物由样品发射的荧光图14-4共聚焦扫描示意图反光镜样品放大器数模转换器计算机*31激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器*355.图像处理Detector1Detector2False-colordifferentialimage第五节生物芯片在生物医学中的应用一、基因差异表达谱分析*37二、DNA测序三、基因突变的检测四、基因诊断五、药物研究开发六、蛋白质芯片的应用一、DNA芯片与基因差异表达谱分析*38(一)探针的设计与芯片的制作(二)待测样品核酸的提取、扩增与标记(三)杂交反应与杂交后清洗(四)扫描、分析及结果讨论

cDNA*39(一)探针的设计与芯片的制作1.探针的设计--寡核苷酸探针设计原则*402.探针的制备3.玻片的多聚-L-赖氨酸预处理4.探针的打印与固化反转录荧光标记：组织或细胞抽提总RNA分离

mRNAAAA…AAA3’oligodT引物dNTP,RT-ase荧光标记dCTP或…

SS-cDNATTTTTT5’(二)待测样品核酸的提取、扩增与标记*41(Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组)后续步骤：1.终止反应降解模板(总RNA或mRNA)；2.过凝胶过滤柱滤去游离的荧光核苷酸；3.洗脱、浓缩、真空干燥获取纯化的核酸样品；4.溶解(DEPC处理的水)成样品液*42注意事项：若用Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(分别标记2种样品)，则应相应调整其余3种dNTP的浓度。对同一种dNTP，既要加入荧光标记的，也要加入非标记的(如Cy3-dCTP与dCTP)，并调整两者的比例，使杂交信号最强。不同来源的样品分别用不同颜色的荧光素标记(Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组)，以便比较分析；*43芯片杂交与常规分子杂交相似，但探针不标记，而待测核酸(液相)标记。分析过程：预杂交杂交洗涤干燥检测(扫描与分析)影响因素：探针碱基组成及其浓度靶核酸长度、碱基组成及其浓度温度杂交液的组成条件设置：高离子强度、高样品浓度、长时间、低温度(杂交)(三)杂交反应与杂交后清洗*441.图像分析将扫描得到的Cy3/Cy5数据通过划格，确定阳性杂交点及其背景，过滤(减去)背景，得到基因表达的荧光信号强度(值)。通常用Cy3/Cy5荧光强度的比值来鉴别差异表达基因(多用平均值表示)。(四)扫描与分析*45(1)标准化处理将某些看家基因Cy3/Cy5荧光强度平均比值调节为1。(2)比值分析一般认为，Cy3/Cy5在0.5-2.0范围内不存在显著的差异表达基因；若超出此范围，则存在差异表达基因。2.数据的标准化处理与分析*46(1)cDNA探针的质量控制PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定：应显示单一清晰条带。(2)总RNA的提取与鉴定1)电泳鉴定：应显2条带(18SrRNA及28SrRNA)；2)紫外吸收值测定：A260/A280均应在1.9-2.0之间。3.结果与讨论*47(3)杂交结果的扫描与分析对照组(以绿色Cy5标记)，见图14-6中的(1)所示每个探针3个点的阳性杂交信号均一性及3次实验的重复性均较好。空白与阴性对照均无信号或很弱,[图(1)和图(2)中倒1行第13-18个点及第7-12个点]图(1)和图(2)中倒1行第1-6个荧光点分别代表阳性参照GAPDH的Cy3和Cy5信号强度，且Cy3/Cy5=1.0处理组(以红色Cy3标记)，见图14-6中的(2)所示表明：探针是特异的，结果是可靠的。*48BiologicalSampleFunctionalInformation红色表示上调；黄色表示不变；绿色表示下调(4)图像重叠分析*49红色Cy3标记处理组，绿色Cy5标记对照组主要用于已知序列作重测序(resequencing)杂交测序(sequencingbyhybridization,SBH)是用DNA芯片上的探针集合（4N），与样品核酸的靶序列（长度为N）进行分子杂交，再据杂交图谱排列出靶DNA的碱基順序。二、DNA测序举例：DNA芯片上原位合成8mer探针

{具48(65536)个点阵}12nt的靶序列杂交杂交图谱*50（一）探针设计的叠瓦式策略(tilingstrategy)以突变区每个碱基为中心依次向左、右两边延伸，选取一定长度(15-25个碱基)的靶序列，合成与其互补的寡核苷酸片段作为野生型探针；然后将中央位点的碱基分别替换成其它三种碱基，得到3个突变型探针。三、基因突变的检测每组探针之间像叠瓦片一样错开一个碱基；N个碱基长度的突变区就需要N组探针，每组含1个野生型和3个突变型的探针；共获4N个探针。然后以下一个位为中心，设计另一组探针。靶分子…GCAAACGAGTCAAAAGTCC野生型探针AC突变型探针GT靶分子…GCAAACGAGTCAAAAGTCC野生型探针AC突变型探针GT以下一个位点为中A心设计另一组探针： C

GT对称中心......................................................................................................................N组探针；4N个探针*52寡核苷酸探针设计、合成，在其末端加上10~15个碱基的polyT作为连接分子臂，分子臂末端进行氨基修饰，如加上氨基臂PO4(CH2)6NH2。玻片通常先采用氨基硅烷(3-氨丙基三甲氧基硅烷等)处理，再以1,4-苯二异硫氰酸盐处理，使氨基转化为具有可与氨基反应交联的异硫氰酸基。将加有polyT分子臂和氨基臂PO4(CH2)6NH2的寡核苷酸探针在处理后的玻片上点样、反应而牢固地结合在玻片表面。（二）微阵列制作过程*53...GCAAACGAGTCAAAACTCC...TTTGCTCAGTTTTCATTTGCTCCGTTTTCATTTGCTCGGTTTTCATTTGCTCTGTTTTCATTGCTCACTTTTCAGTTGCTCAATTTTCAGTTGCTCATTTTTCAGTTGCTCAGTTTTCAG靶分子探针TGCATTTGCTCAGTTTTCATGCATTTGCTCAGTTTTCA发生T-G纯合突变；T-A和T-G杂合突变（三）基因突变检测(图14-8)*54...................................................病原体检测样品的标记可以采用随机引物延伸法或PCR扩增法；可平行、高通量、综合性地检测大量基因；快速、敏感、准确；不需要使用放射性核素；可以对疾病进行前瞻性诊断。四、基因诊断人等高度复杂的基因组DNA样品，用限制性内切酶进行消化后再标记效率会更高。特点：*551.药物筛选2.合理用药3.中草药鉴定五.药物研究开发

寻找疾病相关基因作为药物筛选的靶标；人类疾病动物模型的评价。

不