酶学分析技术2016

第五章酶学分析技术12简介内容：一、酶的基础知识二、酶含量的表示方法三、酶促反应动力学四、酶促反应进程第一节 酶学分析技术基本知识3一、酶的基础知识4高效性、高度特异性、高度不稳定性、可调节性酶的应用：酶（enzyme）：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂酶的催化特点：酶活性/含量的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断。酶的组成和命名由于酶的特异性强，催化反应的速度快，反应条件温和等，因此酶试剂一般化学试剂，具有更高的特异性和灵敏度，更易于自动化，可为临床更加及时地提供准确的检验信息。胰蛋白水解酶5二、酶含量的表示方法酶测定标本及方法类型标本：

组织细胞

体液：以血浆或血清为主测定方法：

酶质量测定：绝对质量，以g/L为表示单位

酶活性测定：相对质量，以U/L为表示单位7(一)、酶活性浓度表示方法酶活性（enzymeactivity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。表示方法：或式中v：反应速率，[P]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。8酶活性单位定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）国际单位IU（µmol/min）Katal单位（mol/s）91．惯用单位：20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位ALP的金氏单位（King）氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4μmolNADH为一个卡门氏单位举例：金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。102.国际单位IU（µmol/min）定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。IFCC,2001年37℃3．Katal单位定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal＝1mol/s。IU与Katal单位的关系：1katal=60×106IU，1IU=16.67nkatal国际单位IU25℃单位U37℃11酶活性浓度酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.计算公式:产物的增加量每单位规定的保温时间1000（ml）酶单位/升=—————————×——————————×————————

每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量（ml）分光光度法测定的公式：

（A测定–A对照）·V总·106

每单位规定的保温时间酶单位/升=—————————×————————

·L·V标实际保温时间正常上限升高倍数（ULN）概念：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上限所得倍数。即ULN＝酶活性实测值正常参考范围上限例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常参考范围上限为40mmol/L，其ULN＝80/40＝2原理：用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位报告结果。如ng/ml或μg/L等。优点：1、灵敏度高；2、特异性高3、无活性酶蛋白测定4、适于同工酶测定不足：1、抗体难以制备；2、方法繁杂；3、测定成本高(二)、酶质量浓度表示方法15三、酶促反应动力学16研究内容：(初速度,单因素)研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学。指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性或代谢物浓度。研究意义:(一)、酶促反应机制

E+SES→E+P

米-曼氏方程(数学表达式)

v=—————

v代表反应速度

Vmax代表最大反应速度

〔S〕代表底物浓度

Km米氏常数Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价值。Vmax〔S〕〔S〕+Km19Km的含义:

当Km=[S]时，，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。Km的意义：Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关鉴别酶的种类反映酶对底物亲和力的大小选择酶的最适底物或天然底物设计适宜的底物浓度20Vmax的含义定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值。计算公式为：

(单位是s-1)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）TN=底物转化量（mol/s）/酶量（mol）

=Vmax

/

[E]

（二）、Km与Vmax的应用2.鉴定酶的种类

Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。1.Km的计算表.某些酶的Km值

酶

底物

Km(mmol/L)乳酸脱氢酶丙酮酸0.017己糖激酶D-葡萄糖0.05D-果糖1.5-半乳糖苷酶D-乳糖4.0碳酸酐酶H2CO39.0过氧化氢酶H2O225蔗糖酶蔗糖28糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸1083.反映酶与底物的亲合力

Km值越大，酶与底物亲合力越小，Km值越小，酶与底物亲合力越大。4.选择酶的最适底物

当酶可有几种底物时，其Km值最小者，为该酶的最适底物。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物。5.设计适宜的底物浓度

酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的92%左右，当［S］在10～20km是，反应初速度可达90%～95%Vmax。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。

6.Vmax可用于酶的转化率的计算

25四、酶促反应进程26以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A延滞期线性期非线性期27（一）延滞期（lagphase、延迟期

）特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A线性期非线性期R1R2延滞期孵育期延滞期28（二）线性期特点：可代表酶促反应速度最大反应速度期，是测定酶活性最佳时期，持续时间1－5min。此期反应速度与底物浓度无关，而与酶活性成正比。线性期（零级反应期）：概念：酶促反应速度达到最大并保持恒定速度进行反应的时期29（三）非线性期（偏离线性期、平坦期）进入非线性期的原因：反应的不断进行，底物消耗越来越多，可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。特点：若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方成正比，为一级反应。30酶学分析技术的应用第二节酶活性测定方法第三节代谢物酶学分析技术31酶测定绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法

EE第二节酶活性测定方法32一、定时法原理：定时法是固定时间法的简称，是指底物与酶反应一段时间（t1～t2）后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应,测定这段时间内产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。特点：优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。吸光度At1t2

时间t

图5-6定时法的三种反应进程231二、连续监测法原理：连续监测法是指在酶促反应的线性期每间隔一定时间测定一次产物或底物的变化量,根据其变化量间接求出酶活性浓度，因是测定产物或底物随时间的变化量又称速率法。概念与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应；标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定；连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法；要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求。特点无需停止酶促反应不需添加其他呈色试剂在线性期测定酶活性标本和试剂用量少可在短时间内完成测定连续观测反应进程对仪器要求高（一）直接法指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。测定NAD（P）H的方法测定人工合成的色素原底物的方法测定耗氧量的方法测定pH改变的方法等连续监测法的分类1．测定NAD（P）H的方法原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例如LD、G-6-PD、GLDH等。38人工合成的色素原底物待测酶产物的毫摩尔吸光系数对硝基苯酚磷酸二钠盐（PNPP-Na2）ALP对硝基酚（PNP）（405nm，pH10.3）18.5L-γ-谷氨酰-3-羧基对硝基苯胺GGT2-硝基-5-氨基苯甲酸（405nm，pH8.1）9.492-氯-硝基酚-α-半乳糖-麦芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP）（405nm，pH6.0）6.12-氯-硝基酚-α-岩藻糖苷α-岩藻糖苷酶（AFU）2-CP（405nm，pH6.5）6.22．测定人工合成的色素原底物的方法

原理：一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团被水解或转移，使无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原底物。根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后测定酶活性。

底物和测定对象：39（二）间接法

一步间接法酶偶联法是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。

在反应体系中加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性的试剂，这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化（三）酶活性浓度的计算摩尔消光系数(ε)：在特定条件下，当吸光物质的浓度为1mol/L，吸收池厚为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值A。意义：ε值取决于入射光的波长和吸光物质的吸光特性，亦受溶剂和温度的影响。显然，显色反应产物的ε值愈大，基于该显色反应的光度测定法的灵敏度就愈高。在测酶时，常数K值的选择是很重要的。此值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，K值愈大41代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物浓度的技术。

酶法分析（enzymaticmethod）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。第三节代谢物酶法分析技术

42在代谢物酶学分析技术中，分光光度法仍是最常用的检测方法。根据测定方法的原理不同，一般将其分为单酶反应、酶偶联反应、酶循环反应等。酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序；试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染；酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。

代谢物酶法分析主要优点代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法代谢物酶法分析的方法

43待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为直接法。一、单酶反应测定技术44尿酸+O2+H2O尿囊素+CO2+H2O2胆绿素+H2O胆红素+O2

尿酸在293nm

处有吸收，而尿囊素没有吸收，在293nm

处测定吸光度下降胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降尿酸紫外法测定胆红素测定45在340nm处测定吸光度的增加来进行定量的方法乳酸测定乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸测定

在340nm处测定吸光度的下降来进行定量的方法乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+46酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。二、酶偶联反应测定技术名称缩写符号名称缩写符号乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶POD己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇酯酶CE脲酶肌酐酶(一)工具酶工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。（二）酶偶联反应的原理

在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。1、酶偶联反应测定酶活性的原理2、酶偶联反应测定代谢物浓度的原理（三）常用的偶联指示系统1．脱氢酶指示系统

用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：

P+NAD(P)H+H+

PH2+NAD(P)+可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。50以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)

或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340nm

处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340nm

处吸光度的下降来计算被测物的浓度。血清葡萄糖己糖激酶法测定

Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反应将NADP+转化为NADPH+H+，测定340nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比血清尿素测定

尿素+H2O2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定2．过氧化物酶(POD)指示系统

POD可催化H2O2与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：

POD2H2O2+4-AAP+酚醌亚胺（红色）+4H2O

Trinder反应：

应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定胆固醇酯+H2O胆固醇+O2胆固醇+脂肪酸△4-胆甾烯酮+H2O2红色醌类化合物H2O2+4-AAP+

酚血清总胆固醇氧化酶测定法

缺点：容易受还原性物质（维生素C、尿酸、胆红素、GSH等）的干扰而影响结果的准确性消除方法：双试剂法优点：在可见光范围测定，便于推广应用；对酶的纯度要求不高，生产方便，价格低；灵敏度高于脱氢酶系统Trinder反应55化学名英文缩写最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585

常用的Trinder反应生色基团

表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是蓝色醌类，能避免溶血等色素干扰。

利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。三、酶循环反应测定技术57酶循环法(enzymaticcyclingassay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶(Ea和Eb)的量。