PCR法突变体质粒构建

PCR法突变质粒构建

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L72℃94℃55℃PCR循环1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数变性使双链DNA解链为单链

95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸

70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR的类型和应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记实验原理实验原理实验原理双酶切双酶切连接实验原理XhoI/BamHIXhoI/BamHI引物1和4分别带有XhoI/BamHI转化大肠杆菌DH5αAmp平板筛选无菌落挑取单菌落扩增质粒实验原理酶切验证实验原理引物1：5’-CCGCTCGAGCCAGGAGGAACACGAGA-3’引物2：5’-GTAGAGAATGAATTCAGAGTCCTG-3’引物3：5’-CAGGACTCTGAATTCATTCTCTAC-3’引物4：5’-CGCGGATCCCAGCATAGGAAGGGAGAC-3’引物设计思考题：酶切位点怎样选择？选择双酶切有什么优点？为什么要设计保护碱基？载体的Amp抗性有什么作用？Xho

ⅠBamHⅠEcoRⅠ预期实验结果与讨论图1：产物I电泳图2：产物II电泳图3：产物I回收图4：产物II回收思考题：图1下方比较模糊的条带成因？446bp314bp预期实验结果与讨论图5：全长片段电泳图6：全长片段电泳回收图8：载体酶切电泳图9：载体酶切电泳回收图7：全长片段酶切醇沉回收←736bp思考题：电泳胶浓度及marker选择原则？←736bp图10：小提质粒1-3：不同单克隆4：EcoRλ14marker5-8：不同单克隆13246578图11：BamHI/XhoI酶切验证1-7．不同单克隆酶切8.DL2000marker12345678736bp→预期实验结果与讨论思考题：质粒电泳为什么有多条带？图11未切出片段可能原因？图12：EcoRI单酶切阳性结果