实验1大肠杆菌的培养和分离

生物技术实践目录实验1大肠杆菌的培养和分离实验2分离以尿素为氮源的微生物实验4果汁中的果胶和果胶酶实验6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验8果酒及果醋的制作实验10泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定微生物无细胞结构：病毒有细胞结构原核生物真核生物细菌放线菌蓝藻支原体真菌原生生物微生物：一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称．认识微生物所有的细菌所共有的基本结构有哪些？某些细菌所具有的特殊结构有哪些？思考：（拟核）基本结构特殊结构细菌的结构细胞壁结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进入细胞；④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素细胞壁的成分？肽聚糖结构化学本质功能或应用细胞壁细胞膜细胞质基质核糖体质粒贮藏性颗粒拟核主要是肽聚糖保护和维持细胞形状等同真核生物同真核生物多种成分新陈代谢的主要场所小型DNA分子同真核生物同真核生物控制细菌的抗药性、固氮、抗生素生成多种成分贮藏营养物质或代谢废物，如淀粉粒、硫粒大型环型DNA控制细菌主要遗传性状基本的结构芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察常见的三种细菌典型形态球菌

杆菌弧菌细菌的革兰氏染色

革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌需氧型：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根瘤菌等。厌氧型：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，大肠杆菌，乳酸菌等。异养需氧型异养厌氧型自养需氧型自养厌氧型问：细菌的代谢类型属于什么方式?在生态系统中处于什么地位?分解者或消费者生产者自养硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。异养大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。细菌的代谢20分钟——30分钟，分裂一次二分裂是细菌最普遍、最主要的繁殖方式。延长菌体，DNA复制细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长→形成横隔膜，同时形成横隔壁→产生两个子细胞。垂直于长轴分裂细菌的繁殖——二分裂

无鞭毛的球菌：菌落较小较厚、边缘整齐.

有鞭毛的细菌：菌落大而扁平、边缘波状或锯齿状.问：菌落在生态学上属于什么单位？菌落菌落可以作为菌种鉴定的重要依据。单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。大肠杆菌酵母菌放线菌霉菌白色或乳白色，光滑大肠杆菌菌落：影响微生物生长的环境因素

微生物的生长速率随温度的上升而加快细胞内的蛋白质和核酸等发生了不可逆的破坏。微生物的生长速率会急剧下降1、温度

微生物生长最旺盛时的温度叫最适生长温度在最适生长温度范围内超过最适生长温度以后多数细菌：6.5～7.5；真菌：5.0～6.0；放线菌：7.5-8.5。影响酶的活性，细胞膜的稳定性等影响微生物对营养物质的吸收等。2、pH每种微生物的最适pH不同超过最适pH范围以后3、氧根据微生物对于氧的需要可以将微生物分为：好氧型微生物兼氧型微生物厌氧型微生物（多数细菌和大多数真菌）（如：酵母菌）（如：某些链球菌、甲烷杆菌）环境中氧含量的状况，对不同代谢类型的微生物群体的生长具有不同的影响。碳源氮源生长因子无机盐水微生物需要的五大类营养要素物质微生物需要的营养物质概念来源作用碳源凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质无机碳源

CO2NaHCO3等有机碳源

糖类脂肪酸花生粉饼石油等①构成细胞物质和一些代谢产物②异养微生物的能源1、微生物的碳源概念来源作用氮源无机氮源

N2、NH4+、

NO3-、NH3等有机氮源

尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能够为微生物提供N元素的营养物质主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物2、微生物的氮源哪些微生物能够利用分子态氮？氮源能否为微生物提供能量？思考概念成分作用为什么不可缺少？常见的生长因子微生物生长不可缺少的微量有机物有机物酶和核酸的组成成分缺乏合成这些物质所需酶或合成能力有限维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等3、生长因子设计一个实验证明胱氨酸是肠膜状乳杆菌所需的生长因子。培养基不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方2、培养基的种类1、成分水、碳源、氮源、无机盐、生长因子同时还要达到pH值、渗透压、氧气等要求（1）按物理状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。液体培养基：增菌固体培养基：纯化，增菌半固体培养基：动力检测，保种培养基的用途选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物鉴别培养基EMB培养基鉴别大肠杆菌

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。

合成培养基:天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染。1.无菌操作的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。无菌操作_________必须无菌、_________也必须要无菌、___________时不能带入其他杂菌主要包括：杂菌2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。各种器具培养基转移菌种高压蒸汽灭菌洒精灯灼烧灭菌干热灭菌灭菌方法：煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒法（酒精、氯气等）紫外线消毒法消毒方法：3、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿接种环等金属器具手提式灭菌锅1kg/cm2、121℃下维持15min.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。练一练分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、污水、土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的_____中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入__________都会对人体产生危害。大肠杆菌是_______工程中被广泛采用的工具。肠道泌尿系统基因革兰氏阴性菌代谢类型：异养，兼性厌氧型生长适宜温度：37℃左右大肠杆菌（E.coli）实验一大肠杆菌的培养和分离实验目的1、进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2、进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。

一、实验目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、实验重点和难点：三、技能目标：（一）培养基的配置与灭菌取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离封口膜：既通气又不使菌进入操作过程（二）倒平板灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。倒平板操作①②③④注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.接种方法（四）大肠杆菌的划线分离划线分离法和涂布分离法划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。平板划线的操作注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养12~24h问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.【典例解析】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前答案：B解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。