综合性实验流式细胞术检测细胞DNA含量

综合性实验：

流式细胞术检测细胞DNA含量山东师范大学生命科学学院邢维贤实验原理流式细胞术（flowcytometry）是利用流式细胞仪（flowcytometer）对悬浮细胞或微粒进行快速、多参数分析的现代细胞分析技术，能够同时定量检测单个细胞的多项指标。流式细胞仪的发展起源于对细胞计数自动化的研究。1934年，moldvan报道了对流动的细胞如红细胞、染色后的酵母菌的检测方法。1947年，Gucker等首次采用了鞘液原理对气体中的微粒进行计数。1953年，Crosland-Taylor成功设计了鞘液系统。将待测的细胞悬液缓慢的注入一个快速流动的液流中，使该细胞液包绕在细胞悬液的外侧，形成鞘流（sheathflow），而细胞悬液始终处于轴流状态。根据牛顿流体在圆形管中流动规律的认识：鞘流速度越快，载物通过的能力越强，并且具有较强的流体动力聚集作用，据此，设计了流动室。实验原理1956年，coulter原理：在一个微孔两侧充满电解质溶液，通电时电流通过微孔，在压力系统控制下细胞或者颗粒流过微孔时，使微孔的截面积减小，由于细胞或颗粒的电阻与电解质相差较大，可以检测出微孔两侧电压变化脉冲，电脉冲的强度和个数则可以获得有关细胞大小和数目的信息。现代流式细胞术对数据采集和分析的技术是从组织化学发源的，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新的设想（1）细胞的组分是可以通过分光光度学来定量测量的；（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。因此，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，以此作为鉴别细胞的依据。实验原理VanDilla和LosAlamos小组在1967年研制出液流束、照明光轴、检测细胞光轴三者相互正交，这是流式细胞计的基础。首次采用Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并能够在DNA直方图上清楚的显示出细胞周期的各个时相。1972年，LenHerzenberg等人在斯坦福大学研制出一台荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activatedcellsorter,FACS），它标志着流式细胞仪商品化时代的到来。流式细胞仪的结构

StructureofFlowCytometer

流动室及液流驱动系统流式细胞仪激光光源激光束成形系统光学系统的结构组成信号监测、存贮、显示、分析系统细胞分选系统

流动室和液流驱动系统

FlowChamber(FlowCell)将待测细胞制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，从而使鞘液能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。激光光源与光束成形系统

Laser,lightamplificationbystimulatedemissionofradiation流式细胞仪以激光作为发光源，经过聚焦后产生的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。前向角散射（FSC），与细胞直径正相关，常以此做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。侧向角散射（SSC），与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、细胞质、细胞核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内部结构和颗粒的信息。仅仅根据FSC/SSC就可以区分外周血中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞。光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。在FCM的光学系统中最主要的光学元件是滤光片，主要有三类：长通滤片（LP）、短通滤片(SP)和带通滤片(BP)。信号检测与分析系统

SignalScanandAnalysis荧光信号的面积和宽度1、所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量采用面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。2、荧光信号的宽度常用来区分双联体细胞。3、通过设“门”可以将双联体细胞排除，其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL-W）要比单个G2期细胞大，因此射门后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。常用的荧光标记染料流式细胞术的数据表示形式实验仪器及材料实验仪器：流式细胞仪partec-cyflow实验材料：Hela细胞实验试剂：磷酸盐缓冲液、PI染液实验步骤制备单细胞悬液，细胞计数调整为1X106个/ml。加入PBS，300-400g离心5min。弃上清加入70%乙醇，4℃固定过夜。离心，弃乙醇，加入PBS重悬。筛网过滤，离