第六章细菌、病毒 2

第六章细菌和噬菌体的重组和连锁本章重点1．细菌影印法研究。2．细菌和病毒的四种遗传分析方法：转化、接合、性导、转导。3．掌握F+、F–、F'、Hfr×F–的特点。4．理解和掌握中断杂交和重组作图的原理。5．噬菌体结构和基因重组特点。学时：10细菌和蓝绿藻：一个线条状或环状染色体(单倍体结构)；无典型的有丝分裂和减数分裂；染色体传递和重组方式与真核生物不同。E.coliT4Phage病毒：比细菌更简单；在寄主细胞内以集团形式产生；属于只有一条染色体的单倍体。第一节细菌和病毒在遗传学

研究中的地位一、细菌：1.大小：细胞较小、长约1~2µ

(1µ＝1/1000mm)、宽约0.5µ；2.结构：鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体、核糖体3.遗传物质：单个主染色体、一个或多个小染色体(质粒)4.涂布和繁殖：每个细胞在较短时间内(如一夜)能裂殖到107个子细胞→成为肉眼可见的菌落或克隆(clone)。5.生理特性突变：①营养缺陷型：丧失合成某种营养物质能力，不能在基本培养基上生长；原养型：野生菌株则可在基本培养基上生长。用不同的选择性培养基测知突变的特性。②抗性突变型：如抗药性或抗感染性。例如：青霉素（penr）抗性突变的菌落。培养基中加有青霉素

二、病毒：单倍体，仅一条染色体。病毒→蛋白质外壳+核酸。病毒分类：寄主：动物、植物、细菌等；遗传物质：DNA或RNA。烟草花叶病毒腺病毒T4噬菌体爱滋病病毒

RNA

DNA

DNA

RNA

表6-1噬菌体对于分子生物学研究具有重要意义。

三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性：

1．世代周期短：大肠杆菌（E.coli）20分钟可繁殖一代。

2．便于管理和生化分析：个体小，一般在1µ至几µ之间，操作管理方便。3．便于研究基因突变：

裸露的DNA分子（有的病毒为RNA分子），容易受环境条件的影响而发生突变；单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，隐性突变也能表现出来。

4．便于研究基因的作用：

影印培养，易检出营养缺陷型突变，有利于从生化角度来研究基因的作用。

5．便于研究基因重组：细菌具有转化、转导和接合作用，可以进行精密的遗传分析。6.便于研究基因结构、功能及调控机制：细菌和病毒的遗传物质简单，易于进行基因定位、结构分析和分离，基因的表达调控也适于采用生理生化的方法进行深入研究。

7.便于进行遗传操作：

染色体结构简单，没有组蛋白和其它蛋白的结合，更宜于进行遗传工程的操作。四、突变型筛选

要得到特定表型的突变型，主要不是依赖使用不同的诱变剂，而是依赖于采用不同的筛选方法。

1.

糖发酵性突变株Lac-选择：可Lac+将和Lac-涂布于伊红-美蓝（EMB）培养基上，Lac+可形成有金属光泽的紫色菌落，而Lac-则形成白色菌落，因此很容易识别。

2.抗性突变体选择：把经过诱变处理的细胞直接涂布到含有某种噬菌体或抗菌素的培养基上，形成的菌落克隆就是抗性突变。

3.营养缺陷型突变的选择：如选择氨基酸营养缺陷型，可先把经诱变剂，如X射线、紫外线或化学诱变剂等处理的细菌涂布在含有所有20种氨基酸的完全培养基上，这种培养基能使各种营养缺陷型生长，培养的目的是通过细胞分裂使突变型充分表现。

待菌落出现后，用印迹法（replica-platedmethod）把它们影印到基本培养基上鉴别出在不含任何氨基酸的培养基上不能生长的克隆，然后再把这一克隆培养到只含一种氨基酸的培养基上，从而判定该突变型需哪种氨基酸才能生长。

测定突变的方法──影印法：黎德伯格等（LederbergJ.和LederbergE.M.,1952）设计。LederbergJ.,1958Nobel奖获得者，发现细菌转导和接合第二节细菌的遗传分析

一、细菌的杂交细菌主要是无性繁殖，1946年发现不同品系大肠杆菌可以杂交，并进行基因重组，从而首次发现了大肠杆菌也有“性别”。

命名：野生型或营养缺陷型：按照菌株所不能合成的物质的前三个字母来命名，右上角标上“+”或“-”分别代表野生型和缺陷型（突变型）。抗生素敏感或抗性：取前三个字母，右上角标上s或r，代表敏感或抗性，例如，链霉素敏感的写成strs，对链霉素抗性的写成strr。

不同营养缺陷型的大肠杆菌：

A菌株：Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。

B菌株：Met+bio+

thr-leu-，需加苏氨酸和亮氨酸。

*A菌株和B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。

*

A+B菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养基上，长出原养型（Met+bio+thr+leu+）菌落。DemonstrationbyLederbergandTatumofgeneticrecombinationbetweenbacterialcells

这种原养型细胞如何出现？

A、B菌株分别培养在基本培养基上→一边加压和吸引使培养液充分混合→结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。

∴直接接触（接合）是原养型细胞出现的必要条件。A菌株B菌株大分子可通过，细菌不能通过滤片U型管的实验（Davis，1950）

A、B菌株中都有链霉素敏感型（Strs）和抗链霉素突变型（Strr

）。在不含链霉素的基本培养基上将这两个菌株进行正反交，即Astrs×Bstrr与Astrr×Bstrs

，结果都可以得到原养型菌落；在含有链霉素的基本培养基上进行同样杂交时，只有Astrs×Bstrr得到原养型菌落，而杂交中Astrr×Bstrs未产生原养型菌落。

说明菌株A和菌株B在杂交中起着不同的作用，菌株A相当于雄性，是遗传物质的供体（donor），而菌株B相当于雌性，是遗传物质的受体(receptor)。

在含有链霉素的基本培养基中，Astrs×Bstrr的杂交能得到重组原养型菌落，因为供体虽然对链霉素敏感，不能分裂，但链霉素并不影响供体的基因转移。受体是对链霉素抗性的，所以在含有链霉素的培养基中既不影响细胞分裂，也不影响它接受外源遗传物质而发生重组，从而形成原养型菌落。

反交Astrr

×Bstrs得不到原养型，因为受体对链霉素敏感，虽然供体能转移遗传物质，但受体细胞不能分裂，所以不能形成原养型菌落。

遗传物质是单向转移的。海斯（HayesW.,1952）证明：接合过程是一种单向转移，A菌株遗传物质→B菌株，从供体（donor）到受体（receptor）。二、F因子

1.概念

F因子（Ffactor或Felement）：又称性因子（sexfactor）或致育因子（fertilityfactor），是能够独立增殖的环状DNA分子，是一种附加体。

F因子是一种封闭的环状DNA分子，相对分子质量约为3.5×106，全长约为6×104个bp，大约为大肠杆菌环状染色体全长的2%。他可以以游离状态存在于细胞质中。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F＋表示。未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F－表示。2.F因子结构包含3个区域

（1）原点（origin）是转移的起点；（2）致育基因（fertilitygene）使它具有感染性，其中一些基因是编码形成F纤毛（Fpilus）的蛋白质，既纤毛与F-细胞表面的受体相结合，在两个细胞间形成细胞质桥；

（3）配对区（pairingregion）与细菌染色体多处的核苷酸序列相对应，因此F因子可以分别地与染色体上这些同源序列配对，通过交换整合到染色体中，成为细菌染色体的一部分。3.F因子的三种状态：以大肠杆菌为例：

①没有F因子，即F－；

②一个自主状态F因子，即F＋；

③一个整合到自己染色体内的F因子，即Hfr。

4.自主状态时

F因子独立进行分裂。

三、接合（conjugation）：

1.概念：是指原核生物的遗传物质从供体（donor）转移到受体（receptor）内的过程。特点：需通过细胞的直接接触。Bacteriacantransferplasmids,throughconjugation2.F因子的传递：带F因子的细菌较少。具有F因子的菌株可以作为供体。

∵

F因子中有形成F性伞毛（Fpilus）的基因→接合管→

F＋细胞中的F因子由接合管向F－传递→

F－受体变成F＋。

F＋×F－：先形成接合管，F因子的DNA边转移边复制，F－细胞F＋细胞。(a)duringconjugation,thepiluspullstwobacteriatogether(b)next,abridgeformsbetweenthetwocells

低频重组（lowfrequencyrecombination,Lfr）：F+和F-之间杂交只有F因子的传递，而细菌染色体并不转移，因此尽管F因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，因此F+品系称为～。3.Hfr细胞的形成及染色体的转移：F因子整合到细菌染色体上（F＋→Hfr细胞），其繁殖与细菌染色体同步进行。此时，细菌基因的重组频率增加4倍以上，∴染色体上整合有F因子的菌株，称为Hfr菌株。

在Hfr×F－结合时，细菌染色体由一小段单链的F因子为前导而转移到F-受体→边进入边合成。一般仅小部分细菌染色体能够转入，接合中断→受体细胞为F－，F因子仍留在供体内。InsertionoftheFfactorintotheE.colichromosomebycrossing-over

高频重组（highfrequencyrecombination,Hfr）：F因子整合到细菌染色体中，与F-细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在它们之间就可以发生重组，重组频率可达10-2以上，故称为Hfr品系。ThetransferofE.colichromosomemarkersmediatedbyF.4、细菌接合重组的特点

在接合期间，Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，一般说很少有整条Hfr染色体转入F-细胞的。所以：

（1）

F-细胞得到的只是F因子的一部分，F因子其余部分依赖于整条Hfr染色体的转移。这样在Hfr×F-杂交中选出的大多数重组子仍为F-。

（2）F-受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体（partialdiploid）或称为半合子（merozygote）。

外基因子（exogenote）：在部分二倍体细胞中，供体提供的部分基因组称为~。内基因子（endogenote）：在部分二倍体细胞中，受体提供完整的基因组，称为~。∴受体和供体的重组就是内基因子与外基因子之间的重组，而且这种重组不同于真核生物的完整的二倍体重组。部分二倍体：当F＋或Hfr的细菌染色体进入F－后，在一个短时期内，F－细胞内的某些位点就会成为二倍体DNA。部分二倍体中发生交换:

单数交换：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是不能成活的。

偶数交换：产生可遗传的重组体和片段。

①如果内外基因子只发生单交换，则环状染色体被破坏，形成的线状染色体不能复制，因而含有这种线状染色体的细胞就不能繁殖。只有偶数次的交换才能保持细菌染色体的完整性，产生有活性的重组子。

②偶数次交换得到的重组子只有一种类型，因为相反的重组子（reciprocalrecombinant）是一个线状的片段，照例不能复制，随着细胞分裂而被丢失，所以重组后细胞所产生的菌落不再是部分二倍体，而是单倍体。CrossoverbetweenexogenoteandendogenoteinamerozygoteThemerozygoteAsinglecrossoverleadstoapartlydiploidlinearchromosomeAnevennumberofcrossoversleadstoaringplusalinearfragment四、中断杂交

50年代，雅科（JacobF.）和沃尔曼（WollmanE.）：

中断杂交试验：发现接合时遗传物质转移是直线进行。

其方法为：

①Hfr菌株与F-菌株混合培养。

Hfr菌株：strsa+b+c+d+对链霉素敏感

F-菌株：strr

a-b-c-d-

抗链霉素②不同时间取样→搅拌器中断杂交→

稀释→含链霉素完全培养基→

杀死Hfr细菌→

抗str细菌菌落→

影印培养法：鉴定a+b+c+d+各基因转移时间。例题：Hfr菌株：苏氨酸(thr+)、亮氨酸(leu+)、抗叠氮化物(azir)、抗T1噬菌体(tonr)、半乳糖(gal+)、乳糖(lac+)、strs

。F-菌株：thr-、leu-、azis、tons、gal-、lac-

strr型。

在时间t=0时，让这两种细胞培养物混合进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交，将中断接合的细菌接种在几种不同的培养基上，测定形成了何种重组子。

中断杂交实验结果表明，在接合开始后，Hfr的不同非选择标记可与F-细胞的染色体在不同时间形成重组子。①8分钟时：thr+进入F-细胞；

8.5分钟时：leu+进入F-细胞；②9分钟时：出现叠氮化物抗性的菌落，少数azir基因进入F-细胞；③11分钟时：出现抗噬菌体T1的F-细菌；④18和25分钟时：分别出现乳糖和半乳糖发酵基因，即lac+和galb+进入F-细胞。①．重组体中各标志基因进入F-

细胞中时间不同，达到最高水平的时间也不同；②．随时间的推迟，某个基因的重组率增加；一定程度后，重组率便不再增加。如：10`tonr首次出现，15`时40%、25`后80%。∴Hfr中基因是按一定的线性顺序依次进入F-菌株的。Interrupted-matingconjugationexperimentswithE.coli

中断杂交技术（interruptedmatingtechnigue）：在若干不同的选择培养基（selsctivemedia）上，分析Hfr染色体上其它非选择性标记基因进入F-细菌的顺序和所需时间（分钟），绘制出连锁图。这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为～。基因转入时间（min）频率thr+leu+azistonslac+gal+88.59111825100（选择标记）100（选择标记）90704025表6-2大肠杆菌Hfr

thr+leu+lac+gal+azistonsstrs×F-

thr－leu－lac－gal－azirtonr

strr

的结果

不同基因所能达到的稳定转移频率不同，这表明它们与thr和leu座位之间以及它们之间的顺序和距离不同。

Hfr细菌的基因按一定的时间顺序依次地出现在F-细胞。因为基因在染色体上，染色体从这一端开始称为原点，以线性方式进入F-细胞中。

基因离开原点越远，进入F-越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程（transferprocess）停止以前，仍未转移，因而斜率较低，达到的最高值也较小。

以基因出现的时间为标准→作出E.coli的遗传连锁图。

用基因转移时间进行作图，图距单位用分钟来度量，全部染色体转移需90分钟，每分钟以3.3×104bp即1.2μmDNA的均衡速度进行转移，因此大肠杆菌整个环形遗传图为90min。

同一个Hfr菌株的转移的起始点以及转移顺序在不同实验中都是相同的，但是一个F+品系可产生许多Hfr品系，这是因为F因子在细菌染色体上有许多插入位点而且其插入取向不同而形成的。

用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验，则他们的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同。

用一种大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交实验，作出连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序不同。Hfr类型原点基因转移顺序HfrH

O

thr

pro

lac

pur

gal

his

gly

thi1

O

thr

thi

gly

his

gal

pur

lac

pro

2

O

pro

thr

thi

gly

his

gal

pur

lac

3

O

pur

lac

pro

thr

thi

gly

his

galAB312

O

thi

thr

pro

lac

gur

gal

his

gly转移的顺序是不是随机？例如：thrthigly

。

每一Hfr菌株的基因顺序虽不相同，但不是随机的。任何线性的Hfr染色体的形成都可用F因子插入环状染色体的不同地点来说明。CirculationoftheE.colichromosome差异：不同Hfr菌株转移的原点(O)和转移

方向不同。进一步说明F因子和细菌染色体都是环状。五、重组作图（recombinationmapping）

中断杂交是根据基因转移的先后次序，以时间为单位进行基因定位的。

重组作图是根据基因间重组率进行基因定位的。两种方法相互补充，提高基因定位的精确性。

基因距离较远中断杂交作图很有效。基因距离较近，基因间转移时间＜2分钟时，仅用中断杂交实验进行基因定位不精确可靠，应采用传统的重组作图法。中断杂交可为重组作图提供某些基因之间连锁关系及其前后次序的依据。例：根据中断杂交实验已知二个基因紧密连锁:

lac-（乳糖不发酵）

ade-（腺嘌呤缺陷型）

Hfrlac+ade+×F-lac-ade-杂交中是lac+

先进入F-受体，而ade+后进入。

①因为供体Hfr转入片段不能独立复制，如果未进入F-受体的基因组中去，那么在以后的细胞分裂中就丢失了；②如果已进入F-基因组中去，而且在缺乏腺嘌呤的培养基上表型为F-lac+ade+，这显然是这两个基因之外发生双交换的产物，lac-ade这两个基因之间并未发生重组；Hfrlac+ade+转入受体后将会发生：

③表型为lac+ade-，这种类型在缺乏腺嘌呤的培养基上就不能生长，所以筛选不出来，而且对测定这两个基因之间的图距也没有意义，因为可能是lac+进入，而ade+还未进入F-细胞；

④只有在缺乏腺嘌呤的完全培养基上选出lac-ade+才是真正的重组子。因为已知ade+是在lac+之后进入F-细胞，既然ade+已进入，lac+也已先进入，所以选出重组子F-lac-ade+必然是外基因子和内基因子在这两个基因之间发生交换的结果。

F-lac-ade-在缺乏腺嘌呤的条件下是不能生长的，当然对于计算这两个基因之间的图距也没有意义。因此lac与ade之间的图距应为：

RF(lac-ade)

用重组频率（RF）所测得的基因间距离与用中断杂交以时间（T）为单位的基因间距离基本上是一致的。

两个位点间的时间约为1分钟，两个值的比RF：T约等于20，即它们之间的关系大约是1min等于20个图距单位。六、F′因子与性导F+与Hfr两种菌株可以相互转变，F因子可以插入到染色体中去，形成Hfr菌株；又可通过规则的交换和剪切，从染色体上完整地游离下来形成F+菌株。

F因子整合过程：可逆：发生环出时，F因子又可重新离开染色体。整合环出OriginandreintegrationoftheF′factor

Adelberg和Burns(1959)：

*

F′因子（F′-factor）：

F因子偶尔在环出时不够准确，会携带出染色体上的一些基因，这种因子称为F′因子。

*

F′因子携带染色体的节段大小：从一个标准基因到半个细菌染色体。

由于F因子在细菌染色体上插入位置不同而构成不同的Hfr品系，由此形成不同的F′因子。它们各自携带细菌的不同基因和不同长度的DNA片段，有的F′因子携带若干个基因的一大段细菌的染色体。F′因子使细菌带有某些突出的特点：⑴F′因子转移基因频率极高，如同F因子转移频率；⑵F′因子自然整合率极高，并且整合在一定的座位上。∵携带与细菌染色体一样的同源区段；而正常F因子可在不同座位整合。

性导（sexduction或F′-duction）：指接合时由F′因子所携带的外源DNA整合到细菌染色体的过程。雅科和阿代尔伯格发现：特殊的Hfr菌株能把lac+

等位基因高频率地转移到Flac-受体中。∵①lac基因位于远端，中断杂交实验中只1/1000重组率；②由F′携带lac+基因进入受体后可在lac位点上形成部分二倍体F′lac+/lac-。

F′因子转移细菌基因不同于Hfr菌株。

1.Hfrthr+leu+strs×F-thr-leu-strr

筛选出F-:thr+leu+strr重组子

2.F′thr+leu+strs×F-thr-leu-strr

筛选出F′:thr+leu+strr重组子

杂交中把混合培养物涂布在含链霉素的基本培养基上，第一个杂交选出的菌株都是F-，因此不能将thr+leu+转入F-菌株。

第二个杂交选出的菌株都带有活性的F`因子，能与其他F-菌株杂交，并能将thr+leu+转入F-菌株，而且这些菌株也具有F′因子，所以都是F+，仍具有感染能力。

产生F′因子的Hfr菌株仍保持单倍体状态，F′因子转入到受体细胞之后，由于引入了供体细胞的部分基因，从而构成了部分二倍体。性导在遗传学

分析中的作用部分二倍体如果不发生重组

1.F′因子自主复制，可在细菌细胞中延续下去；

2.性导所形成的部分二倍体可用作不同突变型之间的互补测验→确定这两个突变型是属于同一个基因或是两个不同基因；3.观察由性导形成的杂合的部分二倍体中某一性状的表现→确定等位基因中的显隐性关系；

4.分离出大量F′因子（每个F′因子携带有不同大肠杆菌基因）

→利用不同基因在一起的并发性导的频率来作图；部分二倍体如果发生了重组

即F′因子所携带的供体细菌染色体同受体细菌染色体之间的同源重组，如果发生了单交换，就导致F′整合形成Hfr品系，同时F′因子上所携带的基因发生重组；如果双交换，则形成F′品系，只是F′因子的细菌基因和受体染色体的等位基因之间发生互换。并发性导(co-sexduction):是建立遗传图的另一手段，两个位点必须密切相连才能处在同一个F′因子上。获得两个位点间重组率→每个片段的连锁群。

性导作图法与转导作图法相同。三种不同的致育因子的相互关系

1.F′是带有部分细菌染色体F因子，它的性质在F和Hfr之间。Hfr通过交换，可以形成带有部分细菌染色体的F′因子，而F′因子又可通过交换整合到细菌染色体的原来位置，回复到以前的Hfr状态。

2.F′因子连同它所带有的部分细菌染色体可一起转移到F-细胞，其转移速率近于F因子。

3.有F因子的细胞是F+细胞，没有F因子的细胞是F-细胞。F因子由供体进入F-细胞，使受体细胞成为F+细胞，但供体细胞仍为F+，其染色体很少转移。F因子可通过简单交换整合到细菌染色体上，形成Hfr染色体。反过来，通过简单交换，又可从Hfr染色体产生F因子。不同的Hfr菌株的染色体转移起始点和方向不同，这是由于F因子整合的位置和方向不同的缘故。

4.Hfr能以高频率把细菌染色体转移到F-细菌中，而F因子因位于Hfr染色体的最末端，极少进入。F′因子和F因子很容易转移到F-细胞中，但供体染色体的转移率很低。SummaryofthevariouseventsthattakeplaceintheconjugationcycleE.coli七、转化（transformation）概念：某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。1928年，格里费斯（GriffithF.）在肺炎双球菌中发现转化现象。1944年，阿委瑞（AveryO.T.）进行肺炎双球菌转化试验；证实遗传物质是DNA；转化是细菌交换基因的方法之一。转化的条件：细菌活跃摄取外源DNA分子；具备重组程序所必需的酶。转化三种细菌：肺炎双球菌；枯草杆菌；流感嗜血杆菌。转化的两个例子：①用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合→可以发现带有双抗性的细菌。细菌裂解→DNA残留→其它细菌摄取转化。②枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细胞摄取。（一）供体与受体的互作：①转化片断的大小：肺炎双球菌转化：DNA片断至少有800bp；枯草杆菌的转化：DNA片断至少有16000bp。②供体DNA分子存在的数目：供体DNA分子数目与特定基因的成功转化有关。链霉素抗性基因转化：每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。

原因：细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNA接受座位，故一般细菌摄取的DNA分子数<10个。③受体的生理状态：感受态是处于刚停止DNA合成、而蛋白质合成继续活跃进行时的状态。活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA。

只有感受态受体细胞才能摄取并转化外源DNA，而这种感受态也只能发生在细菌生长周期的某一时间范围内。（二）转化DNA的摄取和整合过程：

①结合与穿入：双链DNA分子结合在受体座位上（可逆），可被DNA酶降解；接受座位饱和性。

DNA摄取(不可逆)，不受DNA酶破坏。

穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解其中一条链。

②联会：按各个位点与其相应的受体DNA片段联会。亲缘关系越远，联会越小、转化的可能性越小。↓③整合(重组)：

是指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换→稳定地进入到受体DNA。对同源DNA具有特异性。异源DNA，视亲缘关系远近也可发生不同频率整合。

（三）连锁判断

①如果A和B是连锁的，当DNA浓度下降时，AB同时转化频率和A或B转化频率下降程度相同；

②如果A和B不连锁，AB转化频率下降将远远超过A或B转化频率下降的程度，因为在较低的浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比关系。（四）转化频率低的原因：

1.受体细菌细胞壁只在特定区域形成临时通道，允许外源ＤＮＡ片段通过。２.外源ＤＮＡ进入还必须有酶或蛋白质分子以及能量的协同作用。（五）细菌的转化与作图转化中供体DNA片段可以携带若干个基因，连锁基因可同时被转化，但同时被转化的基因不一定连锁。黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验：

DNA片段进入受体细胞后，可与受体染色体发生重组。紧密连锁的两个基因有较多的机会在同一个DNA片段中→同时整合到受体染色体中。

枯草杆菌菌株trp2+his2+tyr1+

作为供体，提取其DNA向受体trp2-his2-tyr1-菌株进行转化。

trp2+his2+tyr1+

×

trp2-his2-tyr1-座位转化体类别trp2+---+++his2++-+--+tyr1+++--+-11940366068541826001071180亲本型（++）重组型（+-）和（-+）重组值trp2-his211940+11802600+107+3660+4180.34trp2-tyr111940+1072600+1180+3660+6850.40His2-tyr111940+3660418+1180+685+1070.13三者并发转化的频率高，故这3个基因是连锁的，其中his2和tyr1连锁最为紧密：单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；只有双交换和偶数的多交换才有效。第三节噬菌体的遗传分析

MicrographofabacteriophageattachingtoabacteriumandinjectingitsDNA

一、噬菌体的结构：1.结构简单：

蛋白质外壳、核酸、某些碳水化合物、脂肪等。2.多样性的原因：外壳的蛋白质种类、染色体类型和结构。3.两大类：①烈性噬菌体：T噬菌体系列（T1~T7）；②温和性噬菌体:P1和λ噬菌体。T4噬菌体从大肠杆菌中释放（一）烈性噬菌体

1.概念：烈性噬菌体（virulentphages）：感染宿主细胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。2.结构大同小异，外貌一般呈蝌蚪状：

T偶列噬菌体

颈部：中空的针状结构及外鞘；尾部：由基板、尾针和尾丝组成。头部：双链DNA分子的染色体；3.T偶列噬菌体的侵染过程（如T4噬菌体）尾丝固定于大肠杆菌，遗传物质注入→破坏寄主细胞遗传物质→降解细菌的染色体，为自身DNA合成提供游离的核苷酸，→合成噬菌体遗传物质和蛋白质→组装许多新的子噬菌体→溶菌酶裂解细菌→释放出大量噬体。T4噬菌体侵染大肠杆菌的生活周期PhageT4,showinitsfreestateandintheprocessofinfectinganE.colicellAgeneralizedbacteriophagelyticcycle（二）温和噬菌体

1.概念：温和（溶源性）噬菌体（temperatephages）：感染宿主细胞后具有裂解和溶源两种发育途径。

例如：λ和P1噬菌体，λ和P1各代表一种略有不同的溶源性类型。2.溶源性噬菌体的生活周期：①λ噬菌体：噬菌体侵入后，细菌不裂解→附在E.coli染色体上的gal和bio位点间的attλ座位上→整合到细菌染色体，并能阻止其它λ噬菌体的超数感染。λ噬菌体特定位点的整合②P1噬菌体：不整合到细菌的染色体上，而是独立存在于细胞质内。

原噬菌体：整合到宿主基因组中或在染色体外以游离形式存在的噬菌体。仅少数基因活动，表达出阻碍物关闭其它基因。原噬菌体经诱导可转变为烈性噬菌体→

裂解途径。3.P1和λ噬菌体的特性：①

P1和λ各代表不同的溶源性类型：

P1噬菌体：侵入后并不整合到细菌的染色体上，独立存在于细胞质内；

λ噬菌体：通过交换整合到细菌染色体上。②溶源性细菌分裂→两个子细胞：

P1噬菌体复制则使每个子细胞中至少含有一个拷贝；

λ噬菌体随细胞染色体复制而复制，细胞中有一个拷贝。③共同特点：核酸既不大量复制，也不大量转录和翻译。P1和λ噬菌体的生活周期特性

温和噬菌体的感染周期

生活周期分为裂解途径溶源途径裂解周期（lyticcycle）溶源周期（lysogeniccycle）Alternativecellcyclesofatemperatephageanditshost

溶源性细菌（lysogenicbacterium）：带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌的现象称为溶源性，这样的细菌就称为～。非溶源性细菌（non-lysogenicbacterium）：失去原噬菌体的细菌称为～。

溶源性细菌有两个重要特性：

1.免疫性：细菌细胞内已有了侵入的噬菌体，再也不会受到同一种噬菌体的侵染。

2.可诱导性：通常由于原噬菌体的自发诱导，每一代可能有万分之一溶源性细菌被裂解，释放出大量噬菌体，这一过程称为裂解周期。用紫外线或化学物质诱导，90%的溶源性细菌进入裂解周期，完成组装的完整噬菌体释放出来。二、溶源性的遗传基础

原始E.coli菌株对于λ温和噬菌体来说是溶源菌。如果F+与F-细胞间进行杂交，发现杂交结果与所用的溶源菌菌株有关。Zygoticinduction

正交F+

(λ)×F-，即F+细胞是带有λ噬菌体的溶源菌时，几乎不产生溶源性重组子。∵在Hfr(λ)×F-中，Hfr菌株的前端基因可在F-受体中出现，但后端基因的重组子得不到。

反交F+

×F-(λ)，即F-细胞是带有λ噬菌体的溶源菌时，可偶尔产生溶源性重组子。

∵在杂交Hfr×F-(λ)中，Hfr基因转移到F-细胞，所以有Hfr基因的溶源性F-重组子很容易得到。

合子诱导（zygoticinduction）：溶源性Hfr与非溶源性F-受体杂交时，经过一定时间，λ原噬菌体进入一个无免疫能力的细胞，原噬菌体随即开始复制，使细胞裂解，释放出游离的噬菌体，这个现象叫~。原噬菌体进入非溶源性细胞后，使受体细胞裂解，这样在λ噬菌体转移以后才进入F-细胞的Hfr后端基因就无法得到了。三、噬菌体突变的基因重组与作图

1.噬菌体遗传性状分为两类：

形成的噬菌斑形状：指噬菌斑大小、边缘清晰度、透明程度。

寄主范围：指噬菌体感染和裂解的菌株范围。2．T2突变型的两点测交①正常噬菌体r+：缓慢溶菌，噬菌斑小而边缘模糊。

r–突变体（rapidlysis，速溶性）：快速溶菌，噬菌斑大而边缘清楚。②寄主范围突变体：指能克服噬菌体抗性的突变体。例：h+

噬菌体：只侵染大肠杆菌B株→半透明噬菌斑。

h–突变株：能利用B株和B/2株→透明噬菌斑。

③双重感染：

h–和h+均能感染B株→可用T2两个亲本h–r+和h+r–同时感染B菌株。

h–r+(透明，小)×h+r–(半透明，大)

↓同时感染B菌株获得噬菌体子代

亲本型：h–r+，h+r–

重组型：h–r–，h+r+将亲本型和重组型混合子代

↓感染混合有B和B/2菌株的培养基

↓h–r+(亲)：噬菌斑透明、小，边缘模糊h+r–(亲)：噬菌斑半透明、大，边缘清楚h–r–(重组)：噬菌斑透明、小，边缘清楚h+r+(重组)：噬菌斑半透明、小，边缘模糊表型推导的基因型透明，小半透明，大半透明，小透明，大h-r+h+r-h+r+h-r-④重组值计算：重组值=重组噬菌斑数/总噬菌斑×100%

=[(h+r++h–r–)/(h+r–+h–r++h+r++h–r–)]×100%去掉%即可作为图距。AdoubleinfectionofE.colibytwophagePlaquephenotypesproducedbyprogenyofthecrossh

－r＋

×h＋

r－

⑤不同的快速溶菌突变型在表型上不同，记作ra、rb、rc，用不同快速溶菌突变型h+rx-与宿主范围突变型h-rx+杂交。重组值随着r基因的不同而有变化，可以据此作连锁图。h+r-×h-r+获得试验结果列于下表：

分别作出ra

、rb

、rc与h的三个连锁图:杂交每一基因型的%重组值h+r+h+r-h-r+h-r-h+ra×

h-r+h+rb×h-r+h+rc×h-r+12.05.90.734.032.039.042.056.059.012.06.40.924/100=24%12.3/100.3=12.3%1.6/99.6=1.6%

四种可能的基因排列连锁图:

？

1234再做杂交：rcrb+

×

rc+rb

↓结果表明:rc—rb的重组值>rb—h∴h位于rb及rc之间，排列顺序→

rc–h–rb。由于T2噬菌体的连锁图是环状的，所以2、3排列都对。

3.T4突变型的三点测交

在噬菌体中也可以用三点测交进行基因定位。用T4噬菌体的两个品系感染大肠杆菌。

一个品系m：小噬菌斑

r：快速溶菌

tu：浑浊溶菌斑另一个品系是对这三个性状都是野生型+++。T4的mrtu×+++三点测交结果类型噬菌斑数百分数%重组频率m-rr-tum-tu亲本类型mrtu+++3467372933.536.1单交换型m+++rtu5204745.04.6√√单交换型mr+++tu8539658.29.3√√双交换型m+tu+r+1621721.61.7√√合计1034212.920.827.1

根据这些结果，可绘制出这三个基因的染色体图：

m←12.9→r←20.8→tu

三点测交所得的8种噬菌斑都可观察到，因为病毒是单倍体，亲本型与重组型可直接从后代中表现出来，直接统计各种噬菌斑类型即可，不必考虑对子代如何进行选择。四、转导（transduction）

1.概念：指以噬菌体为媒介进行的细菌遗传物质重组，是细菌遗传物质传递和交换方式之一。

2.特点：以噬菌体为媒介→细菌的一段染色体被错误地

包装在噬菌体的蛋白质外壳内→通过感染转移到另一个受体细胞内。

∵感染细菌的能力决定于噬菌体的蛋白质外壳。（一）普遍性转导（generalizedtransduction）：可以转移细菌染色体的很多不同部分，这类噬菌体的转导叫做～。

黎德伯格与津德（1951）发现鼠伤寒沙门氏菌中转导现象。（1）将两个沙门氏菌的营养缺陷型进行杂交：phe-trp-tyr-met+his+

×

phe+trp+tyr+met-his-

↓混合培养在基本培养基发现原养型的菌落

频率为1/105但在使用戴维斯U形管时也出现了原养性菌落。（2）产生上述结果的原因:

①是否属于恢复突变?高频率出现不可能是回复突变。

②是否属于接合、性导?戴维斯U型管试验(防止细胞直接接触)→结果也获得野生型重组体，排除由于接合或性导而产生基因重组可能性。

③是否属于转化?

结果表现为不受DNA酶的影响，排除了由于DNA片断通过滤片经转化实现基因重组可能性。

（3）唯一可能的结论是：这种重组通过一种过滤性因子实现。

这种过滤性因子称为FA，不受DNA酶的影响。FA为噬菌体P22（溶源性）。

①滤板孔径允许这种因子通过，因此称为过滤因子，而这种因子大小和质量与P22相同；

②免疫学实验验证这种因子可以被P22抗血清灭活；

③如果用抗性品系来代替敏感品系，那么在U型管的两端都不出现野生型重组了。

④进一步研究也验证了细菌菌株是携带P22原噬菌体的溶源性细菌。

P22在感染细菌细胞时，细菌染色体断裂成小片段。在形成噬菌体颗粒时，偶尔错误地把细菌染色体的片段组装到头部，而不是他们自己的遗传物质。

转导噬菌体（transducingphage）或转导颗粒（transducingparticles）：把细菌染色体片段包装在噬菌体蛋白质外壳内而产生的假噬菌体（不包含噬菌体的遗传物质）。

决定噬菌体的吸附和注入DNA这两种功能取决于它的蛋白质外壳，所以转导颗粒可以吸附到细菌细胞上，并注入他们的DNA。此时噬菌体DNA中包含了部分的细菌基因。

当转导噬菌体内容物注入一个受体细胞后，形成一个部分二倍体，然后导入的基因通过重组，整合到宿主细菌的染色体上。错误包装(1/1000机率)同源重组同源重组

噬菌体携带供体的染色体片段完全是随机的，也就是说，供体基因组中所有基因具有同等机会被转导形成部分二倍体，经交换和重组后，形成不同转导子。各个标记基因转导频率大致相同，这种转导就是普遍性转导（generaltransduction）。Themechanismofgeneralizedtransduction.∵转导噬菌体——一般只有0.3%左右噬菌体基因组大小相当于沙门氏菌的1%∴普遍性转导频率很低，对每一个基因来说转导频率是有限的。频率：1%×0.3%=3×10-5

如果细菌的两个基因之间距离大于噬菌体的染色体长度，一般不能同时进行转导，除非携带不同基因颗粒同时感染同一细菌细胞。频率：10-5×10-5=10-10

共转导或并发转导（cotransduction）：两个基因同时转导的现象。

如果两个基因始终是一起转导或同时转导频率较高，那么可以证明这两个基因是连锁的。两个基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密，相反，共转导频率愈低，则表明这两个基因距离愈远。

双因子转导（two-factortransduction）：每次观察两个基因的转导，通过每两个基因之间的共转导频率可以确定这些基因在染色体上的次序。若要分析３个基因则需做３次双因子转导实验，才能确定这３个基因的次序。

假定这３次实验结果为：①a基因和b基因共转导的频率高；②a基因和c基因共转导频率也高；③b和c基因的共转导频率很低，那么这３个基因的次序就应为b、a、c。

三因子转导（three-factortransduction）分析，则只做一次实验就可推出３个基因的次序。以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu（亮氨酸合成)、thr（苏氨酸合成）、azi(叠氮化钠抗性）三个基因的顺序。每个选择的标记基因进行多次试验：三个位点之间的连锁关系：实验1：

2种可能排列：

azi

leu

thr

√

leu

azi

thr实验2：肯定三个基因的顺序是：

azi

leu

thr实验3：证明这一顺序，因为leu+和thr+片段之间从未携带有azir。实验选择的标记基因未选择的标记基因频率123

leu+

thr+

leu+thr+50%azir2%thr+3%leu+0%azir

0%azir

通过合转导关系求出两基因之间的物理距离：

d=同一染色体上两基因之间的物理距离；

L=转导DNA的平均长度；

X=两个基因共转导的频率。由以上公式可知：

转导DNA的平均长度约为１个病毒基因组的大小；通过试验测知两个基因的合转导频率，就可估算出两个基因间的物理距离。

通过3因子转导可以得到不同类型的转导子及其频率，显然频率最低的一类转导子是最难于转导的，因为它的产生需要同时发生的交换次数最多。这种转导子的3个基因中，两边的应为供体基因，中间的受体基因。

例如：大肠杆菌leu+arg+met+细胞作供体，leu-arg-met-作为受体，由P1噬菌体作为载体进行转导。最初选择的是leu+转导子，然后检查leu+转导子中其他两个基因被转导的情况，得到的转导子类型和数目如下：(1)leu+arg-met-453(2)leu+arg+met-114(3)leu+arg+met+36(4)leu+arg-met+0603IncorporationofalatemarkerintotheF－E.colichromosome

可见：

①第四类基因型的转导子是很难发生的，由此类转导子基因型可以看出这三个基因的排列次序是leuargmet；

②

leu+和arg+在第二、三类转导子中