实验五转基因植物的检测

实验五转基因植物的检测第一页，共二十六页，2022年，8月28日1、检测外源基因在植物细胞中的转录，对外源基因表达调控进行研究，掌握引物的选择、cDNA的合成、RT-PCR检测的原理与方法。。实验目的第二页，共二十六页，2022年，8月28日第三页，共二十六页，2022年，8月28日第四页，共二十六页，2022年，8月28日第五页，共二十六页，2022年，8月28日第六页，共二十六页，2022年，8月28日第七页，共二十六页，2022年，8月28日第八页，共二十六页，2022年，8月28日第九页，共二十六页，2022年，8月28日第十页，共二十六页，2022年，8月28日第十一页，共二十六页，2022年，8月28日第十二页，共二十六页，2022年，8月28日第十三页，共二十六页，2022年，8月28日第十四页，共二十六页，2022年，8月28日第十五页，共二十六页，2022年，8月28日1、材料：转基因植物的RNA或mRNA制备物。非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物2、设备：PCR仪、移液器、PCR管等。3、试剂：10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT;特异引物)、10×OneStepRNAPCRBuffer、25mMMgCl2、10mMdNTP、RNaseInhibitor(40U/μl)、AMV-OptimizedTaq1μl、AMVRTaseXL(5U/μl)、上游特异Primer(20μM)*1、下游特异Primer(20μM)*2、RNaseFreeH2O。实验材料、设备及试剂第十六页，共二十六页，2022年，8月28日实验操作步骤：1）RNA提取：

关键防止RNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。第十七页，共二十六页，2022年，8月28日2、cDNA第一链的合成：取1个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：10×PCRBuffer1μlRNaseFreedH2O5.75μldNTP1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVRTaseTranscriptase0.5μloligodT-Adaptorprimer0.5μlRNA1μlTotal10μl实验步骤第十八页，共二十六页，2022年，8月28日反应条件：

42℃30min99℃5min5℃5min第十九页，共二十六页，2022年，8月28日3、PCR反应取一个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：

10×PCRBuffer

4μl

灭菌蒸馏水9μl

10mMdNTP２.5μl

Taq酶0.1μl

上游特异Primer(20μM)*1

0.2μl

下游特异Primer(20μM)*2

0.2μl

Total16μl

将（1）的反应结果稀释20倍，取10μl加入到（2）管中，轻轻摇匀。第二十页，共二十六页，2022年，8月28日反应条件：94℃2min94℃30s55℃30s72℃1min72℃7min30Cycles第二十一页，共二十六页，2022年，8月28日目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

第二十二页，共二十六页，2022年，8月28日结果与分析利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录；观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。

RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果第二十三页，共二十六页，2022年，8月28日1、将实验结果粘到实验报告上。2、如何选择RT-PCR的反转录引物。3、结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源基因转录表达的优缺点。实验报告第二十四页，共二十六页，2022年，8月28日实验一、质粒三种提取方法的比较为什么要用对数期的菌液提取质粒？因为对数期菌的生长状况和数量最佳,有利于提取质粒

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸钾/2M醋酸这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀第二十五页，共二十