全血基因组DNA的提取

全血基因组DNA提取地中海贫血基因检测概述地中海贫血是由于某类珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性贫血。地中海贫血主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。α-地中海贫血基因诊断操作流程β-地中海贫血基因诊断操作流程实验目的1掌握离心柱法提取全血DNA的检测方法2了解DNA浓度及纯度的检测实验原理(离心柱法)独特的缓冲液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，使蛋白与DNA分离,然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅胶膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅胶膜上洗脱。样品准备用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般有EDTA和枸橼酸钠,肝素对酶反应有可能起抑制作用,如没有特殊要求一般不采用。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。设备和材料56℃水浴箱台式高速离心机微量移液器(200μl,1000μl)1.5ml离心管,离心管架高压枪头及盒卫生纸

试剂准备

血液DNA提取试剂盒主要成分包括：

缓冲液GB缓冲液GD

漂洗液PW洗脱缓冲液TB

蛋白酶K无水乙醇（自备）其他材料：吸附柱CB3收集管1.5ml离心管实验步骤

每组做两个标本，先准备两个1.5ml离心管，编号Ⅰ

样本裂解加20ul蛋白酶加200ul全血加200ulGB颠倒混匀56℃水浴10分钟裂解后样本实验步骤裂解后样本沉淀核酸核酸吸附吸附柱放入收集管中，编号将上一步所有溶液和絮状沉淀分别加入吸附柱中；13000rpm离心30sec倒掉废液,将吸附柱放回收集管中加200ul无水乙醇颠倒混匀注意:动作轻柔实验步骤裂解后样本.漂洗去杂向吸附柱中加入500ulGD,13000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中

向吸附柱中加入600ulPW,13000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中

向吸附柱中加入600ulPW,13000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中柱子开盖室温放置数分钟,以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液沉淀核酸核酸吸附实验步骤裂解后样本.漂洗去杂将吸附柱转于干净1.5ml离心管中;向吸附柱中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB,于室温放置2-5min;13000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中,得到基因组DNA,弃去吸附柱编号保存沉淀核酸核酸吸附洗脱DNADNA检测方法1%的琼脂糖电泳检测DNA分子大小及完整性紫外分光光度法鉴定DNA纯度在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收

OD260/OD280<1.7有蛋白的污染

OD260/OD280＝1.7～1.9纯度很好

OD260/OD280>1.9有部分降解或有RNA污染

DNA浓度计算：紫外分光光度计进行测量

OD260×50ng/ul（双链DNA）×稀释倍数DNA的保存提取的DNA作好标记（标注名称，日期），交上来一起保存与冰箱-20℃。(短期可置于4℃，长期于-70℃分装保存，应避免反复冻融)注意事项使用时注意缓冲液GD和漂洗液PW中有无加入无水乙醇加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。

用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心（或静置）以去除残留的液体及挥发乙醇成分。注意事项因为进行的是PCR实验，所以要注意防止污染，开盖要轻柔，防止液体