原核表达试验技术

TAKARADNA凝胶回收试剂盒目的DNA胶t夬切碎添加ElutionBufferDNA目的DNA胶t夬切碎添加ElutionBufferDNASolution先用酒精灯消毒手术刀，在酶切仪中切胶，把片段放入1.5ml管中，用枪头搅碎。切胶:招SpinColumn安置于新15rnltubeJz1.2.3.加GM试剂溶胶：加入700--800ul左右的GM，放进45℃水浴锅中溶胶。2.3.拿新的过滤柱和离心管，转移溶胶后液体进过滤柱，12000rpm.1min离心，把滤液重新倒进过滤柱，同样离心，后弃滤液。.加WB（加乙醇）清洗：向过滤柱中心加700ulWB，同样条件下离心两次，弃滤液，最后空离30s。.换新的1.5ml离心管，把柱子放入，加30ul的日utionBuffer/DDH2O.（注意要加在中央，不要碰壁）.离心1min，把滤液重新加入到过滤柱中，再离心，得到溶解的DNA液体，弃柱子。.保存：-20℃LB培养液制备（1000ml）.称量：10g胰蛋白胨粉，5g酵母提取物，10gNacl于玻璃瓶，加DDH2O1000ml。.灭菌：把盖子拧松，高压蒸汽灭菌121℃，20min。.置室温降温，后放4℃保存。LB固体培养基制备.向100ml的液培中加入1.5g琼脂粉，高压灭菌20min。.抗生素贮存液：卡那霉素（Kan）贮存液50mg/ml、氨苄西林（Amp）贮存液100mg/ml（均经过0.22pm滤膜过滤除菌），-20℃储存，使用浓度卡那（k+）0.05mg/ml，氨苄（A+）0.1mg/ml。.取出培养液，待其温度降至45—50℃时（不烫手），按照1:1000比例加入抗生素，充分混匀。.倒入6cm一次性培养皿中，静置30—60min（等待平板冷却）。.封口胶封口，倒置保存在4℃，期限为30D。纯化PCR产物（胶回收）（天根试剂盒）.在紫外灯下准确切取含有目的DNA片段的凝胶（体积尽可能小），放入干净的1.5mlEP管（预先称取空管重量）中，称取凝胶的重量。.按每0.1g凝胶加入100ulPC溶液的比例往EP管中加入溶液PC，50℃水浴放置约10min，期间不断温和晃动，确保凝胶完全溶解，此时溶液呈现黄色。.向吸附柱CB2（吸附柱放入收集管中）中加入500ul平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。.将冷却至室温的凝胶溶解液加入吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。.向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液PW（已加入无水乙醇），静置2min后12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，重复步骤一次。.12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。.将吸附柱CB2放入一个干净的EP管中，向吸附膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液EB35ul，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。.将离心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中并将吸附柱放入EP管中，室温放置2min，12000rpm离心2min，将DNA溶液收集到EP管中。.用超微量核酸测定仪测定DNA浓度和纯度，溶液-20℃保存备用。感受态大肠杆菌DH5a和BL21（DE3）的制备.将-80℃冰箱保存的DH5a和BL21（DE3）大肠杆菌甘油保存菌解冻，用酒精灯烧灼过的接种环挑取大肠杆菌，分别在两个LB平板培养基（不含抗生素）上分级化线以能够出现单菌落为宜），将划线平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。.用酒精灯烧灼过镊尖的镊子夹取高压过的无菌小Tip头，在划线平板上挑取单菌落，接种到盛有15mlLB液体培养基的50ml离心管中，37℃、150rpm培养。.培养4〜5h时测定OD600值，当OD600值达至0.35〜0.5时将盛有培养菌液的离心管冰浴放置停止培养。.依次取上述菌体培养液1ml于1.5mlEP管中（根据需求确定EP管数量），4℃、4000rpm离心5min,吸除上清（尽量除尽上清）。.在每个含有菌体沉淀的EP管中加入100ul冰浴预冷的SolutionA,轻轻弹动EP管使沉淀重悬。.4℃、4000rpm离心5min,吸除上清（尽量除尽上清）。.在每个EP管中加入100ul冰浴预冷的SolutionB,轻轻弹动EP管使菌体重悬。感受态大肠杆菌制作完成，可直接用于下游质粒DNA转化实验，亦可-80℃冰箱保存以备以后使用。T载体与sTim-3片段的连接、转化.在200ul微量离心管中配制下列DNA溶液，总量为5W。随后加入5W的SolutionI,16℃连接30min。试剂使用量pMD18-TVector1U1sTim-3片段纯化回收液0.Ipiwl〜0.3pmol对应的体积JH20Upio5u】.将产物加入至100UlDH5a感受态细胞中，轻轻弹匀，冰浴静置30min。同时取10ulsTim-3片段回收液加入一支含DH5a感受态细胞的EP管中作为阴性对照。.42℃加热90s后，迅速转移到冰浴中，静置2-3min；后加入890ul不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃恒温摇床中160rpm振荡培养50min。.吸取200ul培养液（余培养液4℃冰箱保存备用）加到含有Amp的LB固体培养基上，用无菌弯头玻棒将菌液均匀涂开，室温放置直至液体被吸收，37℃倒置培养过夜（12-16h）。.次日挑取单菌落转入含0.5mlLB液体培养基（含Amp）的2mlEP管中，37℃、225rpm振荡培养7h,产物置于4℃冰箱保存。.对培养产物行菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定（步骤2.52）。.吸取0.3ml鉴定阳性的培养液加到含有15mlLB液体培养基（含Amp）的50ml离心管中（按1：50比例稀释），37℃、225rpm振荡培养过夜；次日提取质粒。.对所提质粒进行双酶切鉴定。.选取鉴定阳性的质粒对应的菌液送公司测序。提取重组质粒.柱平衡：将吸附柱CP4放入收集管中，向吸附柱中加入500ul平衡液BL,12000rpm离心1min,倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。.取过夜培养的菌液10ml加入15ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清，再次加入1.5ml菌液，吹打混匀后转入一2mlEP管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。.向含有菌体沉淀的离心管中加入550ul溶液P1（首次使用前先在P1溶液中加入RNase），在涡旋振荡器上振荡彻底悬浮菌体沉淀。.向离心管中加入550ul溶液P2,温和地上下翻转直至菌液变得清亮粘稠（切勿剧烈振荡，以免污染基因组DNA；所用时间不宜超过5min,以免质粒受到破坏）。.待菌体充分裂解后，向离心管中加入770ul溶液P2,温和地上下翻转6〜8次充分混匀（此时会出现白色絮状沉淀），12000rpm离心10min使沉淀聚集于管底。.将过滤柱CS放入收集管中，然后将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS中（每次加入量700ml以内），12000rpm离心2min。.小心地将离心后收集管中得到的液体分次加入已平衡的吸附柱CP4中，12000rpm离心1min,倒掉收集管中废液，将吸附柱CP4放回收集管中。.向吸附柱CP4中加入500ul去蛋白液PD,12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管。.向吸附柱CP4中加入600ul漂洗液PW（漂洗液PW可提前4℃冰箱或冰浴放置预冷），室温静置3min,12000rpm离心1min,倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。重复操作一次。.将吸附柱放回收集管中后12000rpm离心2min,后将吸附柱开盖室温放置数分钟，以彻底去除吸附柱中残留的漂洗液。.将吸附柱转入一个干净的1.5mlEP管中，向吸附膜的中间部