生化实验01-蛋白质含量的测定

实验室规章制度实验室安全（人身安全、财产安全、环境安全）规范操作（2人/组，每人必须动手做实验)实验室卫生（仪器、试剂、器皿、桌面，值日生）实验报告（完整、规范，原始数据，结果分析讨论）不能迟到早退，不能在实验室吃东西12实验01植物组织中蛋白质含量的测定

（Folin—酚试剂法）了解、掌握可溶性蛋白质测定的常用方法。一、实验目的3二、实验原理Folin-酚试剂法（Lowry法）结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。第一步反应：在碱性条件下，蛋白质的肽键与铜结合生成紫红色的蛋白质-铜络合物(双缩脲反应)；第二步反应：此络合物及蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸等使磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关，在650nm下比色测定即可进行定量测定。41.Folin—酚试剂法的特点

（1）灵敏度高：比双缩脲法高100倍。

（2）适用范围：微量蛋白质（0.02～0.50mg/mL）测定.2.干扰因素：

酚类、柠檬酸和巯基类化合物等还原性物质会导致测定结果偏高。5三、材料、设备与试剂（一）实验材料

绿豆芽下胚轴（二）设备

天平；分光光度计；移液器等。（三）试剂

1.Folin试剂甲--试剂A：试剂B=50：1(V/V)现配现用2.Folin试剂乙（已配制）

3.标准蛋白质溶液：250µg/mL。6四、实验步骤

（一）标准曲线的制作管号12345样品溶液标准蛋白溶液(mL)00.20.40.60.81.0mL蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20试剂甲5mL，混匀后室温下放置5~10min试剂乙0.5mL（逐一加入并立即混匀），20~30min后，测定A6507标准曲线绘制：

以每管标准蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度（A650）为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲线。比色测定：

1号管为空白，在650nm波长下用10mm光程的比色皿测定各管的吸光度。A650蛋白质(µg)080.2～0.5g绿豆芽下胚轴于研钵中—→加1~2mL水—→研磨、匀浆后定容至25mL—→室温下放置10~20min（间歇振荡）—→过滤后得到待测样品溶液。分别取样品待测液1.0mL于3支试管中（3次重复）进行显色、测定（参考制作标准曲线的步骤）。（二）样品中蛋白质的提取及测定重现（复）性、严谨性、透明性和独立验证是科学方法的基石生物重复（

biologicalrepeats）实验重复或技术重复（technicalrepeats）9对照组处理组R1R2R3T1T2T3R1-1R1-2R1-3R2-1R2-2R2-3R3-1R3-2R3-3T1-1T1-2T1-3T2-1T2-2T2-3T3-1T3-2T3-33个生物重复3个技术重复10五、原始数据

A650的记录管号12345测定-1测定-2测定-3标准蛋白含量(μg)050100150200A650W=VT=VS=N=六、结果计算标准曲线的绘制：1、坐标纸绘制2、在excel中绘制并求

出回归方程11蛋白质含量（

μg

）A650501001502000.30.20.112X：根据样品的吸光值查得的蛋白质含量（μg）；X1=,X2=，X3=，X平均=13样品中蛋白质的含量（mg/g）＝X：根据样品的吸光值查得的蛋白质量（μg）；VT：提取液总体积（mL）；Vs：测定时取用的样品