- 现行
- 正在执行有效
- 2003-07-30 颁布
- 2003-10-01 实施
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文档简介
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犅41
中华人民共和国农业行业标准
犖犢/犜679—2003
猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法
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20030730发布20031001实施
中华人民共和国农业部发布
书
犖犢/犜679—2003
前言
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。
本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。
本标准主要起草人:王宏伟、王传彬、陈西钊、田克恭。
Ⅰ
书
犖犢/犜679—2003
猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法
1范围
本标准规定了猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)免疫酶试验和免疫酶组织化学方法。
本标准适用于检测猪血清中的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗体和组织中的PRRSV抗原。
2免疫酶试验
2.1材料准备
2.1.1试剂
2.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章。
2.1.1.2抗原涂片的制备:PRRSV接种于生长至70%~80%单层的Marc145细胞。接种后3d~
4d,病变达50%~75%时,用胰蛋白酶消化分散感染的细胞单层,PBS洗涤三次后,稀释至1×106个细
胞/mL。取印有10个~40个小孔的室玻片,每孔滴加10μL。室温自然干燥后,冷丙酮(4℃)固定
10min。密封包装,置-20℃备用。
2.1.1.3标准阳性血清:PRRSV试验感染猪制备的血清。
2.1.1.4标准阴性血清:无PRRSV感染、未经免疫的猪血清。
2.1.1.5酶结合物:辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。
2.1.1.6底物溶液:配制见第A.2章。
2.1.2器材
a)普通光学显微镜;
b)印有10个~40个小孔的室玻片;
c)微量加样器,容量5μL~50μL;
d)37℃恒温培养箱或水浴箱。
2.1.3样品
采集被检猪血液,分离血清。血清应新鲜、透明、不溶血、无污染,密装于灭菌小瓶内,4℃或-30℃
保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号,并用PBS作10倍稀释。
2.2操作方法
2.2.1取出抗原涂片,室温干燥后,滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清,每份血
清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔,置湿盒内,37℃30min。
2.2.2PBS漂洗三次,每次5min,室温干燥。
2.2.3滴加适当稀释的酶结合物,置湿盒内,37℃30min。
2.2.4PBS漂洗三次,每次5min。
2.2.5将室玻片放入底物溶液中,室温下显色5min~10min。PBS漂洗两次,再用蒸馏水漂洗—次。
2.2.6吹干后,在普通光学显微镜下观察,判定结果。
2.3结果判定
2.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下:即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均
无色;阳性血清与正常细胞反应无色,与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色,即可判定结果;否则应
重试。
2.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色,即可判为
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