分子生物学课件

分子生物学第一章绪论

第一节分子生物学的定义和研究内容一、定义分子生物学是从分子水平研究生命现象及其规律的一门新兴、前沿学科。它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构、功能及其在信号传递中的作用为研究对象，其发展非常迅速。分子生物学以其崭新的观点和技术向其他学科的全面渗透，推动了许多学科向分子水平发展。使细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经生物学和生态学由原来的经典学科变成了生命科学的真正前沿科学，形成了一系列交叉学科，如分子遗传学、分子生态学、分子免疫学、分子病毒学、分子病理学、分子肿瘤学和分子药理学等。分子生物学是生命科学的核心前沿。不同种属生物的表现形式多种多样和千姿百态，但是，生命活动的本质却是高度一致的。例如绝大多数生物遗传取决于DNA；除少数例外，遗传密码在整个生命世界中都是一致的。又如核酸一级结构和蛋白质一级结构的对应关系以及蛋白质的有序合成，也表现出高度一致性。

因此，分子生物学开辟了研究各种不同种属生物的生命现象最基本、最重要的途径。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机遇，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。

其中重组DNA(recombinantDNA)技术是现代分子生物学技术的核心。重组DNA技术又称为基因操作(genemanipulation)、分子克隆(molecularcloning)、基因克隆(genecloning)或基因工程（geneengineering）等。这些名词彼此间存在某些微小的差别，在不同情况和不同条件下常常交换使用。“基因操作”定义为：通过任何方法将细胞外构建的DNA分子(或片段)插入病毒、质粒或其他载体系统，形成遗传物质的重新组合，使它们能够进入宿主细胞内，并能在其中继续扩增。而“重组DNA技术”狭义上具“基因操作”相同的含义，但它涉及范围更广泛，甚至泛指分子生物学中与DNA水平研究有关的技术。因此，分子生物学技术已成为推动生物科学的各个领域向分子水平发展的重要工具或手段，也是服务于人类和社会，推动医药和工、农业发展的强大动力。二、分子生物学的研究内容分子生物学的研究内容主要包括以下三个方面。1、核酸分子生物学：主要研究核酸的结构及其功能。2、蛋白质分子生物学：主要研究蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展缓慢。

3.细胞信号转导：细胞信号转导的分子生物学主要研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。

二、现代分子生物学的建立1950年AstburyWT在一次题为“Adventuresinmolecularbiology”讲演中首先使用“分子生物学”这一术语,用以说明它是研究生物大分子的化学和物理学结构。1953年WatsonJD和CrickFH提出“DNA双螺旋结构学说”（生理医学奖），是分子生物学创建的里程碑。该学说启动了分子生物学及重组DNA技术，开创了分子遗传学基本理论的黄金时代。其主要进展有：1953年，Watson和Crick《Nature》杂志上发表一篇震动生物学界的论文“脱氧核糖核酸的结构”。Watson和Crick的DNA双螺旋结构学说已被普遍地视为分子生物学发展的最主要里程碑，也是分子生物学及其技术的重要理论基础。1956年Kornberg,A.,首先发现DNA聚合酶（生理医学奖）；1957年，HoaglandMB等分离出tRNA，并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设；1958年，MeselsonM及StahlFW提出了DNA半保留复制模型；1958年，WeissSB及HurwitzJ等发现依赖于DNA的RNA聚合酶；1961年HallBD等用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；这些工作使RNA转录合成的机制得以逐步阐明。三、现代分子生物学的深入发展(一)重组DNA技术的发明1．基因克隆工具酶的发现：1970年，SmithHO在微生物中发现一组目前称之为限制性核酸内切酶的酶类，简称限制酶(restrictionenzyme)。（生理医学奖）Temin等从肉瘤病毒(一种逆转录病毒)中发现了一种逆转录酶(reversetranscriptase)（生理医学奖）2．DNA片段的体外连接：1972年，BergP和JacksonDA等首次将两个不同生物体来源的DNA片段，在DNA连接酶的作用下进行连接(或重组)，产生了第一个重组DNA分子。3．质粒的构建：1973年，CohenS构建了第一个可用于DNA分子克隆的载体——质粒（plasmid）。4．核酸杂交技术：1969年，PardueML等首先建立了细胞原位杂交技术。1975年，SouthernEM发明一种印迹杂交技术，被称为Southern印迹或Southern转移技术。5．DNA序列分析技术：1977年，剑桥大学SangerF等创建了双脱氧末端终止法测定DNA序列，与此同时，美国MaxamI和GilbertW发明了化学裂解法或部分降解法测定DNA序列（化学奖）。6．聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)：1985年，MullisK首创聚合酶链式反应(PCR)技术（化学奖）。该技术在体外模拟细胞内DNA的复制过程，进行体外“基因扩增”。(二)分子生物学技术的应用与发展由于分子生物学的广泛渗透和应用，反过来又推动了重组DNA技术和分子生物学本身的发展。有关这方面的研究进展事例不胜枚举。现仅就具有重大历史意义、影响广泛深远的主要事件简述如下。3．基因组文库的建立：1978年，SmithiesO等建立了第一个人类基因组文库(genomiclibrary)。4．基因工程生产人胰岛素：1979年，GoeddelDV及其同事详细报道了他们成功地用化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中进行了表达。随后EliLilly公司在1982年获准销售基因工程生产的胰岛素。5．转基因动物：1981年，PalmiterR和BrinsterR利用基因转移技术成功地建立第一个转基因小鼠，转基因动物模型的建立，为研究基因功能及遗传病的基因治疗提供了活体模型。6.人类基因治疗研究：1990年4月，美国NIH的BlaeseRM和AndersonWF等首次将腺苷脱氨酶(ADA)基因导入至一位患严重复合免疫缺陷症(SCID)的4岁小孩体内，并取得一定疗效，开创了人类基因治疗（humangenetherapy）的先河，并为20世纪90年代以来基因治疗研究蓬勃开展奠定了基础。7．基因工程抗体技术的建立和发展：人们利用细胞工程技术研制出多种单克隆抗体，为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。8．DNA芯片（基因芯片、生物芯片）技术：是指将大量探针分子固定于固体支持物上，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。通过进一步研究还发现，男女可能存在巨大遗传差异，男性染色体减数分裂的突变率是女性的两倍。并找到了很多与遗传病有关的基因，包括乳腺癌、遗传性耳聋、中风、癫痫症、糖尿病和各种骨骼异常的基因。(四)基因表达调控机制的研究1961年，JacobF和MonodJ最早提出操纵子学说（生理医学），打开了人类认识基因表达调控的窗口。从80年代开始，人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式作用因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是真核基因表达调控的根本所在。1981年，AltmanS和CechTR同时发现了具有催化自我剪接活性的RNA，称之为ribozyme(核酶)（化学奖），参与基因表达的调节。（五）小分子RNA研究进展1993年，LeeRC等发现线虫(C.elegans)lin-4基因编码的小分子RNA，其长度为22～61个核苷酸——反义RNA。反义RNA能与lin-14mRNA的3ˊ非翻译区（untranslatedregion，UTR）反义互补结合，阻断lin-14的翻译，降低线虫早期发育阶段lin-14蛋白的水平。小干扰性RNA(smallinterferingRNA，siRNA)系21～25个碱基对的短双链RNA，是长双链RNA(dsRNA)被细胞内Dicer切割而成。siRNA能诱发细胞内基因沉默，使那些与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制了该基因的表达，这一现象称为RNA干扰（RNAi）。从1957年到2000年从事分子生物学研究的科学家共获得了31项诺贝尔奖。第三节分子生物学与相关学科的关系一、分子生物学与生物化学生物化学与分子生物学关系最为密切。两者在我国教育部和科技部颁布的二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”，两者并重。分子生物学虽然主要起源于生物化学，但它又不同于生物化学。生物化学主要是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的化学结构、转化和新陈代谢。分子生物学则着重阐明生命物质（核酸与蛋白质）的结构与功能的关系、细胞内信号转导途经和基因表达调控的机制。分子遗传学是分子生物学和遗传学相互交叉和渗透的结果。分子遗传学和分子生物学的研究界线越来越模糊，但并不能说分子遗传学就等于分子生物学,因为分子生物学研究范围更广泛，几乎包括生命科学各领域的分子水平研究。四、分子生物学与生物技术根据美国生物技术产业组织的定义：生物技术(biotechnology)是指“利用细胞和分子过程来解决问题或制造产品的技术”。现代生物技术主要包括两个方面：基因（核酸）工程和蛋白质（酶）工程。这两方面的生物技术又统称为分子生物学工程。练习题（1）一、名词解释1、基因表达；2、操纵子3、反式作用因子；4、启动子5、Southern印迹杂交；6、转录图7、生物信息学；8、转化9、α-互补作用；10、锌指结构二、选择题1、原核生物基因表达的特点A只有一种RNA聚合酶；B基因以操纵子为基本单位进行表达；C转录和翻译过程是偶联进行的；D转录产物需要经过加工修饰。2、DNA序列分析的主要应用有A分析基因的精细结构；B用于基因诊断和变异分析；C由基因结构预测蛋白质功能；D用于基因工程和蛋白质工程相关分析。3、提高表达蛋白的稳定性的措施有A让外源基因和宿主基因一起表达，形成融合蛋白；B用酶消化载体；C采用蛋白酶缺陷的突变菌株；D表达分泌蛋白三、问答题1、简述PCR定点诱变法的原理与步骤2、简述DNA芯片技术的应用第二章基因与基因组第一节基因

一、基因概念的起源1865年，现代遗传学的奠基人Mendel通过著名的豌豆杂交实验提出遗传因子学说。1909年Johannsen将遗传因子改称为基因，并提出基因型和表型的概念。基因型(genotype)是逐代传递下去的成对因子的集合，因子中一个来源于父本，另一个来源于母本。表型(phenotype)是指一些容易区分的个体特征的集合。二、基因的化学本质1944年，美国的生物化学家OswaldAvery利用灭活的致病肺炎球菌提取DNA，与非致病肺炎球菌混合培养，使后者转化为具有致病性的细菌，从而证实遗传基因的本质是DNA。1952年，AlfredHershey和MarthaChase利用病毒证实了DNA是遗传物质的携带者。三、基因概念的发展与现代理解Beadle和Tatum在1946年提出了“一个基因一种酶”的理论，并因此获得1958年的诺贝尔生理学和医学奖。但是，对于具有多个亚单位的蛋白质来说，“一个基因一种酶”的假说不够完善。因此，人们提出了“一个基因，一条多肽链”的概念。然而，在DNA分子中，除了编码蛋白质的基因外，还有编码RNA的基因，如编码tRNA、rRNA和snRNA的基因。因此，“一个基因，一条多肽链”的理论也不够完善。现代基因的定义为：基因是核酸中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息以及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。简单地说，基因——指导合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部DNA序列。

四、基因的结构从分子生物学的角度来说，基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列。在基因中用于编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因（structuregene），结构基因两侧的侧翼序列是不编码RNA或蛋白质的DNA片段，但含有基因的调控序列（图2-1）。图2-1基因结构图（一）结构基因

大多数结构基因能通过信使RNA（messengerRNA，mRNA）进一步编码某种多肽或蛋白质，但有少数结构基因仅仅编码一些具有特定功能的RNA，如转运RNA（transferRNA，tRNA），核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）和其他小分子RNA。结构基因的DNA双链都有作为模板链的可能。携带生物信息（RNA序列信息）的那一条DNA链称为信息链或有意义链（sensestrand）。由结构基因转录所得的RNA分子的核苷酸序列与其信息链的核苷酸序列一致，只是以U取代了T。5`-ACGTTCCGA-3`3`-TGCAAGGCT-5`DNA

↓5`-ACGUUCCGA-3`RNA对于编码蛋白质的基因来说，信息链又称为编码链。与信息链互补的DNA单链即为转录模板链（templatesstrand）也称反意义链（antisensestrand）。可以用来合成一条与模板DNA碱基互补的RNA链。原核生物的结构基因是连续的，其RNA合成后不需要经过剪接加工。大多数真核生物基因则在编码区（codingregion）内含有非编码的插入序列，因此被称为断裂基因（interruptedgene）断裂基因——被非编码序列隔断了的不连续的结构基因。其中编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron），内含子和外显子一起转录，形成mRNA前体（precursor），但是在加工过程中被剪切掉，故内含子不存在于成熟的mRNA序列中。经过剪接，由全部外显子连接而成的mRNA参与指导多肽链的合成。在真核生物基因的外显子与内含子接头处都有一段高度保守的一致序列（consensussequence）。即内含子5ˊ端大多数是以GT开始，3ˊ端大多数是以AG结束，这称为GT-AG法则。可以用它作为真核基因中RNA剪接的识别信号。(二)非结构基因

——参与转录调控的顺式作用元件这类调控元件是与结构基因串联、具有调控转录作用的特定DNA序列。由于他们和特定功能的基因连锁在一起，因此称为顺式作用元件（cis-actingelement)。包括：启动子、增强子、沉默子、终止子等。1.启动子和上游启动子元件（1）启动子启动子（promoter）是指能被RNA聚合酶特异性识别和结合，并能启动转录过程的DNA序列。

启动子具有方向性，位于结构基因转录起始点的上游，本身并不被转录。原核生物基因的启动子序列具有较高的同源性。真核基因启动子差别很大，但，几乎所有已发现的真核生物基因的启动子都有TATA盒（TATAbox），其核心序列是TATA（A/T）A（A/T），位于转录起始点上游-25bp左右处，TATA盒与一种被称为TATA因子（转录因子）结合后，成为完整的启动子，精确地决定RNA合成的起始位点。启动子的应用：一个好的启动子具有重要应用价值。（2）上游启动子元件

上游启动子元件（upstreampromoterelements）是TATA盒上游的一些特定的DNA序列。反式作用因子可与这些元件结合，通过调节TATA因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子结合及转录起始复合物的形成来调控基因的转录效率。上游启动子元件包括CAAT盒、CACA盒及GC盒等。CAAT盒含有5ˊ-GGNCAATCT-3ˊ核心序列。GC盒含有5ˊ-CCGCC-3ˊ核心序列，两者位于-70bp和-120bp之间，CACA盒的核心序列为GCCACACCC，位于上游-80bp～-90bp处。2．反应元件一些受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的DNA序列结合。被结合的DNA序列能调控基因的表达。这种能介导基因对细胞外的信号产生反应的DNA序列称为反应元件（responseelements）。能与反应元件结合的信息分子受体叫做反式作用因子，如糖皮质激素受体。糖皮质激素→～受体（蛋白质）活化＋特异的DNA序列（反应元件）→调控基因表达。反应元件都具有较短的保守序列。这些元件通常位于启动子附近和增强子内。糖皮质激素反应元件在增强子内。如热休克反应元件一般在启动子附近。3．增强子

增强子（enhancer）是一段能增强邻近基因转录的DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。反式作用因子与这些元件结合后能够增强邻近基因的转录。增强子的作用：主要通过改变DNA模板的螺旋结构、为DNA模板提供特定的局部微环境；或为RNA聚合酶和反式作用因子提供一种结构，以帮助它们与某些顺式元件相联系等方式而发挥调节作用。增强子在不同的基因中，其位置也不同。

增强子的作用无方向性和基因特异性，也不受基因之间距离远近的影响。增强子是一种正调控序列。增强子的应用：4、衰减子（沉默子）1986年Maniatis等研究干扰素-β（IFN-β）基因转录时发现了负调控序列。他们把这种对基因转录起负调控作用的DNA序列称为衰减子，或沉默子（silencer）。在真核细胞中，沉默子对成簇基因的选择性表达起重要作用。4．加尾信号在结构基因的最后一个外显子中有一个保守的AATAAA序列。这个序列对于mRNA转录终止和加poly(A)尾是必不可少的。AATAAA序列及其下游的一段GT丰富区或T丰富区共同构成poly(A)加尾信号。

poly(A)加尾信号——由AATAAA序列及其下游的一段GT丰富区或T丰富区共同构成的、能终止转录和添加多聚A尾的DNA序列。mRNA转录到此部位后，会产生AAUAAA和GU（或U）丰富区。RNA转录延长因子可以识别这种结构并与之结合，然后在AAUAAA下游10~30个碱基的部位切断RNA，并加上poly(A)尾。第二节基因组一个物种的单倍体染色体数目及其所包含的全部遗传物质，称为该物种的基因组(genome)。换句话说，基因组是细胞或生物体中一套完整单倍体所含遗传物质的总称。人类基因组包括核基因组和线粒体基因组。进化程度越高的生物体其基因组越复杂。一、病毒基因组的结构和功能

病毒(virus)是一种具有比较原始的生命形态和生命特征的非细胞生物。完整的病毒颗粒包括衣壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA，（一）病毒基因组的结构特点

1．不同病毒基因组大小相差较大与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小，但是不同的病毒之间其基因组相差甚大。如乙肝病毒（HBV）DNA只有3.2kb，所含信息量也较小，只能编码4种蛋白质，而痘病毒的基因组有300kb之大，可以编码几百种蛋白质。2.不同病毒的基因组可以是不同结构的核酸病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成。每种病毒颗粒中只含有一种核酸，DNA或RNA，DNA或RNA可以是单链的，也可以是双链的，可以是闭环分子，也可以是线性分子。3．单倍体基因组所有病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。但逆转录病毒基因组例外，它有两个拷贝（其基因组由两个相同的线状正链RNA发展组成，称为二倍体RNA基因组）。4．病毒基因组有连续的也有不连续的。DNA病毒基因组均由连续的DNA分子组成；多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成，但有些是由不连续的核糖核酸链组成，形成所谓分段基因组（segmentedgenome）。如流感病毒的基因组有8个节段。5．基因有连续的和间断的：感染细菌的病毒（噬菌体）基因组与细菌基因组结构特征相似，基因是连续的；而感染真核细胞的病毒基因组与真核生物基因组结构特征相似，有的基因具有内含子，基因是间断的。有些真核病毒的一部分，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因却是外显子。如SV40的早期基因即大T和小t抗原的基因都是从5146位开始，沿逆时针方向进行，大T抗原基因进行到2676位终止，而小t抗原进行到4624位终止。但是，从4900到4555之间有一段346bp的片段是大T抗原基因的内含子，而该内含子是小t抗原的编码基因（图2-2）。6．病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的病毒基因组的编码序列大于90%，只有很小的一部分不编码蛋白质。7．相关基因丛集病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元。8．基因重叠重叠基因（overlappinggene）即同一段DNA片段能够以两种或两种以上的阅读方式进行阅读，因而可编码2种或2种以上多肽。(二)特殊病毒基因组介绍1．乙型肝炎病毒：HBV基因组复制与其它双链DNA病毒不同，是以基因组RNA为模板，在逆转录酶作用下合成DNA。

2．逆转录病毒逆转录病毒属于RNA病毒。所有逆转录病毒的共同特点是能够携带或编码合成逆转录酶（RT）。与其它RNA病毒复制不同的是，当病毒感染细胞后，首先以自身的基因组RNA为模板，在RT催化下合成DNA中间体，即前病毒DNA（provirusDNA）。该DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA上，并且能够作为细胞基因组的一部分，随细胞基因组复制和细胞分裂而传递下去；在宿主RNA聚合酶的作用下，原病毒DNA可以重新转录形成子代病毒RNA。二、原核生物基因组（一）原核生物基因组结构与功能的特点1．基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。2．基因组中只有1个复制起点。3．具有操纵子结构。操纵子（operon）是指数个功能相关的结构基因串联在一起，构成信息区（多顺反子），连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）及其下游的转录终止信号构成的基因表达单位。——由多顺反子及其调控序列构成的基因表达单位。4．结构基因无重叠现象。5．基因序列是连续的，无内含子结构，转录后不需要剪接。6．编码区和非编码区（主要是调控序列）在基因组中约各占50%。7．基因组多为单拷贝基因，重复基因很少。8．具有编码同功酶的基因（isogene）。9．细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。10．在DNA分子中具有多种功能识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录启动区和终止区。(二)染色体外的遗传物质——质粒质粒（plasmid）是独立于许多细菌及某些真核细胞（如：酵母等）染色体外的共价闭合环状DNA分子（cccDNA），是能够独立复制的最小遗传单位。尽管质粒不是细菌生长、繁殖所必需的物质，但它所携带的遗传信息能赋予细菌特定的遗传性状，如耐药性质粒（R质粒）带有耐药基因，可以使宿主菌获得耐受相应抗生素的能力。用途：（三）转座（位）因子转座因子（元件）（transposableelement）即可