药物分析湖南大学第05章巴比妥类药物的分析课件

第五章巴比妥类药物的分析巴比妥类药物是一类临床常用的催眠镇静药。这类药物应用广泛，容易因不合理使用而引起中毒。需要对本类药物的原料、制剂进行分析。有时也需要对生物样品中微量巴比妥类药物进行分析。第一节、化学结构与性质第二节、鉴别试验第三节、特殊杂质检查第四节、含量测定内容目的和要求掌握巴比妥类药物的化学结构与分析方法间的关系；掌握巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥及硫代巴比妥类药物的鉴别;巴比妥类药物的银量法与溴量法测定的原理与方法;熟悉巴比妥类药物的紫外分光光度法;了解苯巴比妥的特殊杂质及其检查。5,5-取代的巴比妥类药物

巴比妥（Barbital）5CCCONONCOH5C2H5C2HH苯巴比妥（Phenobarbital）5司可巴比妥钠（SecobarbitalSodium）5异戊巴比妥（Amobarbital）CCCONONCOH5C2CHCH2CH2CH3CH3H5环己烯巴比妥51,5,5-取代的巴比妥类药物51己琐巴比妥硫代巴比妥类药物

硫喷妥钠HCCCONONCSNaH5C2CH3CH2CH2CHCH352一、主要性质

物理性质

白色结晶或结晶性粉末，具有固定的熔点；游离巴比妥类药物微溶或极微溶于水，易溶于乙醇及有机溶剂；其钠盐则易溶于水，而不溶于有机溶剂。

化学性质弱酸性

巴比妥类药物分子结构中都有1,3-二酰亚胺基团，能发生酮式和烯醇式的互变异构，在水溶液中可以发生二级电离。 本类药物的水溶液显弱酸性（pKa为7.3～8.4），可与强碱形成水溶性的盐类。

巴比妥钠盐的水溶液呈碱性，加酸酸化后，析出结晶性的游离巴比妥类药物，可用有机溶剂提取出来。与强碱的成盐反应：CONHCNCOOHR1R2C+NaOHCONHCNCOONaR1R2C+H2O水解反应巴比妥类药物的分子结构中含有酰亚胺结构，与碱液共沸即水解，释放出氨气，可使红色石蕊试纸变蓝。CONHCNCOOHR1R2C+5NaOHR1R2CHCOONa+2NH3+2Na2CO3本类药物钠盐在吸湿的情况下也能水解，在pH=10以下，水解较慢，pH=11以上，酸水解速度加快。H2OH2OCOONaR1R2CONHCONH2CR1R2CHCOONa+2NH3+2Na2CO3CONHCNCOONaR1R2CCONHCNCOONaR1R2C+AgNO3+Na2CO3+NaNO3+NaHCO3CONCNCOONaR1R2CAg+AgNO3CONCNCOONaR1R2CAg+NaNO3CONCNCOOR1R2CAgAg与铜盐的反应

巴比妥类药物在吡啶溶液中生成的烯醇式异构体与铜吡啶试液反应，形成稳定的配位化合物，产生类似双缩脲的呈色反应。铜吡啶试液的配制取CuSO44g，加水90ml使溶解后，加吡啶30ml，生成硫酸二吡啶铜，即为铜吡啶试液。巴比妥类药物+铜吡啶试液紫堇色或紫色↓吡啶硫喷妥钠+铜吡啶试液绿色吡啶有色配位化合物与钴盐的反应

巴比妥类药物在碱性溶液中可与钴盐生成紫堇色配合物。可用于本类药物的鉴别和含量测定。 本反应在无水条件下比较灵敏，生成的有色产物较稳定。因此，所用试剂应不含水。 常用溶剂：无水甲醇或乙醇 钴盐：醋酸钴、硝酸钴或氧化钴 碱：有机碱（如异丙胺）为佳+Hg(NO3)2CONCNCOOR1R2CHH-HNO3CONCNCOOR1R2CHgNO3HCONCNCOOHR1R2CHgNO3CONCNCOOHR1R2CHgNO3+2NH3+H2O+NH4NO3CONCNCOONH4R1R2CHgNO3-+与香草醛反应CONCNCOOR1R2CHCONCNCOOR1R2CHOHOCH3CHCONCNCOOR1R2CHHOHOCH3OHC+Δ紫外吸收光谱特征

巴比妥类药物的紫外吸收光谱特征和其电离程度有关，在不同pH溶液中其紫外吸收光谱发生特征性变化，可用于本类药物的鉴别、检查和含量测定。5,5-取代的巴比妥类药物pH=2酸性溶液中，不电离，无明显的紫外吸收。pH=10碱性溶液中，发生一级电离，于240nm处有最大吸收。pH=13强碱性溶液中，发生二级电离，最大吸收红移至255nm处。巴比妥类药物的紫外吸收光谱H2SO4溶液

(0.05mol/L)缓冲溶液

(pH=9.9)NaOH溶液

(0.1mol/L)(pH=13)Anm未电离一级电离二级电离硫喷妥的紫外吸收光谱HCl溶液(0.1mol/L):NaOH溶液(0.1mol/L):

硫代巴比妥 硫代巴比妥类药物在酸性或碱性溶液中，均有较明显的紫外吸收。

特殊元素及取代基的反应不饱和烃取代基的反应与溴试液或碘试液的反应

司可巴比妥可使溴试液或碘试液褪色。与KMnO4的反应 可还原紫色的KMnO4为棕色的MnO2。芳环取代基的反应硝化反应与NaNO2-H2SO4反应与甲醛-H2SO4反应与硫元素的反应第二节鉴别试验一、丙二酰脲类反应苯巴比妥ChP（2005）【鉴别】本品显丙二酰脲类的鉴别反应（附录Ⅲ）与银盐的反应

取供试品约0.1g，加碳酸钠试液1ml与水10m1，振摇2min，滤过，滤液中逐滴加入硝酸银试液，即白色沉淀，振摇，沉淀即溶解；继续滴加过量的硝酸银试液，沉淀不再溶解。与铜盐的反应 取供试品约50mg，加吡啶溶液（1→10）5m1，溶解后，加铜吡啶试液（硫酸铜4g，水90ml溶解后，加吡啶30m1，即得）1m1，即显紫色或生成紫色沉淀。二、熔点测定及衍生物熔点测定熔点测定巴比妥类的钠盐＋酸→游离巴比妥类药物↓→过滤→洗涤→干燥→测熔点

苯巴比妥钠的鉴别Ch.P（2005）取本品约0.5g，加水5ml溶解后，加稍过量稀盐酸，即析出白色结晶性沉淀，滤过；沉淀用水洗净，在105℃干燥后，依法测定，熔点为174-178℃。衍生物熔点测定鉴别丁巴比妥取丁巴比妥0.5g，加1mol/L碳酸钠溶液5ml使溶解，加4.5％（W/V）对硝基氯苄的乙醇溶液10m1，在水浴上加热回流30min，放置1h后，滤过，所得沉淀用96％的乙醇进行重结晶后，在100～105℃干燥，测定衍生物的熔点，应为150℃左右。三、特殊取代基或元素的反应不饱和烃取代基的反应

含不饱和取代基的巴比妥类药物（如司可巴比妥），分子中的不饱和键可与碘、溴或高锰酸钾作用，使碘、溴或高锰酸钾褪色。与碘液的反应+I2CONCNCOONaH2CCHCHCHH2CCH3H7C3CONCNCOONaH2CCHCHCHH2CCH3H7C3II司可巴比妥钠ChP（2005）【鉴别】

取本品0.1g，加水10ml溶解后，加碘试液2m1，所显棕黄色在5min内消失。与高锰酸钾的反应+2KMnO4+4H2OCONCNCOONaH2CCHCHCHH2CCH3H7C33+2MnO2+2KOHCONCNCOONaH2CCHCHCHH2CCH3H7C3HOOH3（棕色沉淀）利用芳环取代基的鉴别实验硝化反应CONCNCOONaH2CCHH3CCONCNCOONaH2CCHH3CO2NNO2+2KNO3+H2SO4+2H2O+K2SO4与硫酸-亚硝酸反应

本法对巴比妥不显色，可用于苯巴比妥与巴比妥等不含芳环取代基的本类药物的区别。

苯巴比妥ChP（2005）【鉴别】取本品约10mg，加硫酸2滴与亚硝酸钠约5mg，混合，即显橙黄色，随即转橙红色。与硫酸-甲醛反应苯巴比妥与硫酸-甲醛反应，生成玫瑰红产物。巴比妥和其他无芳环取代的巴比妥类药物无此反应，可供区别。苯巴比妥ChP（2005）【鉴别】取本品约50mg，置试管中，加甲醛试液1ml，加热煮沸，冷却，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，使成两液层，置水浴中加热，界面显玫瑰红色。硫元素的反应 硫代巴比妥类分子中的硫元素可在NaOH溶液中与铅离子反应生成白色沉淀，加热后，转变为黑色的硫化铅。可用于硫代巴比妥类与巴比妥类的区别。CONCNCOSNaH2CCHH3CCHCH3H7C3+Pb2+PbSCONCNCOSH2CCHH3CCHCH3H7C32PbΔ

注射用硫喷妥钠ChP（2005）【鉴别】

取本品约0.2g，加氢氧化钠试液5ml与醋酸铅试液2ml，生成白色沉淀；加热后，沉淀变为黑色。四、红外光谱法

《中国药典》收载的巴比妥类药物，几乎都采用红外光谱作为鉴别方法。司可巴比妥钠ChP（2005）【鉴别】本品的红外光吸收图谱与对照的图谱（光谱集137图）一致。五、显微结晶鉴别—特色鉴别反应药物本身的晶形巴比妥：长方形苯巴比妥：球形→花瓣状反应产物的晶形巴比妥＋铜吡啶试液→十字形紫色结晶苯巴比妥＋铜吡啶试液→细小不规则或似菱形浅紫色结晶第三节特殊杂质检查一、苯巴比妥的特殊杂质检查苯巴比妥的合成工艺：CH2CONH2CH2COOC2H5水解，酯化C2H5OH，H2SO4O=COC2H5OC2H5C=C–ONaCOOC2H5COOC2H5缩合C2H5ONa（Ⅰ）酸化，消除HClCHCOOC2H5COOC2H5CCOOC2H5COOC2H5H5C2乙基取代C2H5BrO=CNH2NH2环合CH3ONa，NNOOH5C2ONaH酸析HClNNOOH5C2OHH（Ⅱ）苯巴比妥中的特殊杂质主要是中间体Ⅰ和Ⅱ，以及副反应产物，常通过检查酸度、乙醇溶液的澄清度及中性或碱性物质来加以控制。酸度检查主要用于控制中间体Ⅱ乙基化反应不完全时，与尿素缩合产生酸性比苯巴比妥强的副产物苯基丙二酰脲，能使甲基橙指示剂显红色。在一定量苯巴比妥供试品水溶液中，加入甲基橙指示剂不得显红色，控制酸性杂质的量乙醇溶液的澄清度原理： 主要利用酸性杂质在乙醇溶液中溶解度小来严格控制苯巴比妥中酸性杂质的量。方法： 取供试品1.0g，加乙醇5ml加热回流3min，溶液应澄清。中性或碱性杂质的检查

原理：

该类杂质主要是中间体Ⅰ的副产物（2-苯基丁酰胺，2-苯基丁酰脲），不溶于NaOH试液但溶于乙醚；苯巴比妥具有酸性，溶于NaOH试液。方法：

取供试品1.0g，加NaOH试液10ml，加水5ml与乙醚25ml，振摇1min，分取乙醚层，经干燥滤纸滤过，滤液置于蒸发皿中蒸干，遗留残渣不得超过3mg。二、司可巴比妥的特殊杂质检查司可巴比妥的合成工艺：COOC2H5COOC2H5CH2COOC2H5COOC2H5CCH3CH2CH2CHCH3H缩合CH3CH2CH2CHCH3Br环合H2NCONH2，C2H5ONaNNOOONaHCH3CH2CH2CHCH3HNNOOOHCH3CH2CH2CHCH3HHH+NNOOONaHCH3CH2CH2CHCH3CH2=CHCH2CH3CHBrCH2Br，NaOH丙烯化NaOH，C2H5ONa，CH3COCH3成盐NNOOOHCH3CH2CH2CHCH3CH2=CHCH2H溶液的澄清度原理： 司可巴比妥极易溶于水，水溶液应澄清，否则表明含有水不溶性杂质。 司可巴比妥水溶液易和CO2作用析出司可巴比妥，故水应先煮沸除去CO2。方法： 取供试品1.0g，加新沸过的冷水10ml溶解，溶液应澄清。中性或碱性杂质的检查

原理：

该类杂质主要是合成过程中的副产物（酰脲、酰胺类物质），不溶于NaOH试液但溶于乙醚；方法： 检查方法同苯巴比妥。第四节含量测定 巴比妥类药物的含量测定方法：银量法、溴量法、紫外分光光度法、酸碱滴定法、提取重量法、HPLC法、GC法及电泳法。一、银量法原理：巴比妥类药物可溶性一银盐AgNO3白色二银盐沉淀AgNO3可溶性一银盐（指示滴定终点）注意事项：本法受温度影响较大，在接近终点是反应较慢，难以准确观察滴定终点。二银盐具有一定的溶解度，测定结果偏高。《中国药典》采用甲醇及3%无水碳酸钠溶液溶剂系统，银-玻璃电极系统电位法指示终点。无水碳酸钠溶液需临时新配制（久置可吸收CO2）。银电极需用硝酸浸洗，然后用水淋洗。一、溴量法原理：

凡取代基中含有双键的巴比妥类药物（如司可巴比妥钠），可与溴定量地发生加成反应。NNOOOHCH3CH2CH2CHCH3CH2=CH2CH2H+Br2NNOOOHCH3CH2CH2CHCH3CH2CHCH2HBrBrBr2（过量）

+2KI→2KBr+I2I2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6溴滴定液（0.1mol/L）的配制：

取溴酸钾3.0g与溴化钾15g，加水适量使溶解成1000ml，摇匀。

KBrO3＋5KBr＋6HCl＝3Br2＋6KCl＋3H2O注意事项：操作中要防止溴和碘的逸失。平行条件进行空白试验可减少溴和碘逸失带来的误差。

司可巴比妥钠ChP（2005）取本品约0.1g，精密称定，置250ml碘瓶中，加水10m1，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.1mol/L）25ml，再加盐酸5m1，立即密塞并振摇1min，在暗处静置15min后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10m1，立即密塞，摇匀后，用Na2S2O3滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml溴滴定液（0.1mo1/L）相当于13.01mg的C12H17N2NaO3。含量计算（原料药：剩余滴定法）三、酸碱滴定法在水-乙醇混合溶剂中滴定 原理：

NNOOOHCH3CHCH2CH2CH3CH3CH2H+NaOHNNOOONaHCH3CHCH2CH2CH3CH3CH2+H2O注意事项：溶剂：水-乙醇滴定剂：NaOH指示剂：麝香草酚酞（终点为淡蓝色）操作简单，但终点难以判断，需采用空白对照帮助确定终点。操作过程中易吸收CO2而使终点的淡蓝色褪去，最好采用电位法指示终点。原料药的直接滴定法（空白校正）

T：滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的毫克数V：供试品消耗滴定液的体积（ml）V0：空白消耗滴定液的体积（ml）ms：供试品的质量F：浓度校正因子，在胶束水溶液中滴定 原理：表面活性剂能改变巴比妥类药物的电离平衡，使药物的Ka值增大，酸性增强，从而滴定终点明显。滴定剂：NaOH常用表面活性剂：溴化十六烷基三甲基苄胺（CTMC）氯化四癸基二甲基苄胺（TDBA）非水溶液滴定法 原理：巴比妥类药物在非水溶剂中的酸性增强，从而滴定终点明显。指示剂：麝香草酚蓝或电位法指示终点滴定剂：甲醇钠（钾）的甲醇或乙醇溶液氢氧化四丁基胺的氯苯溶液常用溶剂：二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮、三氯甲烷无水乙醇、苯、吡啶、甲醇-苯（15:85）四、紫外分光光度法

巴比妥类药物在酸性介质中几乎不电离，无紫外吸收，在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构。直接测定的紫外分光度法 将供试品溶解后，根据其pH值，选用相应的λmax处，直接测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度值。

As：供试品溶液吸光度Au：对照品溶液吸光度Cs：对照品溶液浓度(mg/ml)

V：稀释体积(ml)巴比妥类药物的紫外吸收的有关数据注射用硫喷妥钠

ChP（2005）本品为硫喷妥钠100份与无水碳酸钠6份混合的灭菌粉末。按平均装量计算，含硫喷妥钠应为标示量的93.0%～107.0%。取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量（约相当于硫喷妥钠0.25g），置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，量取此溶液用0.4%NaOH溶液定量稀释制成每1ml中约含5g的溶液；另取硫喷妥对照品，精密称定，加0.4%NaOH溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含5g的溶液。照分光光度法，在304nm的波长处分别测定A，根据每支的平均装量计算。每1mg硫喷妥相当于1.091mg的C11H17N2NaO2S。

注射用灭菌粉末

提取分离后的紫外分光度法 如供试品中有干扰物质，可采用提取分离的方法除去干扰物质后，再用紫外分光光度法测定。 可根据巴比妥类药物具弱酸性，在三氯甲烷等有机溶剂中易溶，而其钠盐在水中易溶的特点进行提取分离。差示分光光度法（A法）测定方法：

取两份相等的供试溶液，分别制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸、碱或缓冲液改变溶液的pH，或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂），然后将两者分别稀释至同样浓度，一份置样品池中，另一份置参比池中，于适当波长处，测其吸收度的差值（A值）。

必要条件： 供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在，它们的吸收光谱有显著的差异。 干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响，光谱行为不变。定量依据：

供试品在两种不同的化学环境中分别以x、y表示，干扰物用z表示特点： 吸收度差值（A）仅与待测组分的浓度有关，而与干扰组分无关，即干扰组分的干扰被消除。 保留了通常的分光光度法简易快速、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。

五、高效液相色谱法

多用于制剂及体液中的巴比妥类药物的测定。例：血清中苯巴比妥、苯妥英和卡马西平的测定

色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18柱 流动相：水-甲醇-乙腈（45:45:10）

流速：1.0ml/min

柱温度：30℃

内标：阿普唑仑的甲醇溶液(5μg/ml) 检测波长：254nm

样品处理： 于60℃水浴中N2吹干，加提取液(三氯甲烷:乙酸乙酯=50:50)2ml,涡旋混合5min，4000r/min离心10min，取有机相1ml置塑料离心管中，于60℃水浴中N2吹干，用流动相200μl溶解，取20μl进样。

计算方法：

在对照品与内标峰面积比值与对照品浓度之间建立标准校正曲线（n=5）。六、电泳法

具有分离度高、样品和试剂用量少、快速的特点，适用于巴比妥类药物体内含量分析。例：尿样中苯巴比妥和巴比妥的测定

色谱柱：熔融石英毛细管柱 背景电解质：甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH=11)

样品电解质：甘氨酸-盐酸钠缓冲液(pH=5.5)

分离电压：12.5kV

操作温度：24℃ 检测波长：214nm

内标：司可巴比妥

样品处理： 精密量取尿样400ml于离心管中，调节pH4.0，依次加入50μl内标和50μl200mmol/L甘氨酸溶液,涡旋混合1min，加入400μl乙酸乙酯，振摇2min，11180r/min离心10min，取有机相至另一离心管（两次提取），真空抽干，以乙醇复溶解，加入样品电解质缓冲液至400μl。

计算方法：

在对照品与内标峰面积比值与对照品浓度之间建立标准校正曲线（n=5）。七、气相色谱-质谱法

采用直接固相微萃取GC-MS可同时测定人体液中异戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、环己烯巴比妥、戊巴比妥、扑米酮和甲苯巴比妥等七种巴比妥类药物的含量。例：血样中七种巴比妥类药物含量的测定

仪器：岛津GCMS-QP5050A；色谱柱：HP-1

载气：氦气；流速：1.1ml/min

进样口温度：270℃；接口温度：240℃ 柱升温程序：100℃(1min)

280℃20℃/min 定量m/z：异戊巴比妥(156)、苯巴比妥(204)、司可巴比妥(168)、环己烯巴比妥(221)、戊巴比妥(156)、扑米酮(190)、甲苯巴比妥(218)样品处理：

精密量取0.5ml待测血样，加入1.5ml高氯酸于去除蛋白质，涡旋混合1min，1630r/min离心10min，精密量取1.5ml上清液，放于有磁搅拌子和0.5g硫酸钠的2ml微反应管中，以0.1mol、/L氢氧化钠试液调节pH6.0～7.0，封口后放入加热器中，60℃搅拌加热15min后，将SPME萃取头插入样品也中萃取，继续搅拌60min，取出萃取头后，直接插入GC进样口，解吸10min后分析。本章学习要求掌握巴比妥类药物的化学结构与分析方法间关系弱酸性水解性与重金属离子的反应掌握巴比妥类药物的鉴别：与重金属的反应特殊取代基和硫元素的鉴别试验掌握巴比妥类药物含量测定的原理与方法银量法测定：溴量法测定：紫外分光光度法测定自测题巴比妥类药物具有的特性为：A.弱碱性B.弱酸性C.易与重金属离子络合D.易水解E.具有紫外特征吸收硫喷妥钠与铜盐的鉴别反应生成物为()紫色绿色蓝色