南京农业大学49课件

分子生物学第七章基因的表达与调控（上）——原核基因表达调控模式2/10/20232南京农业大学生命科学学院第七章基因的表达与调控（上） 自然选择倾向于保留高效率的生命过程。 原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应无保障，只有根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。因此，原核细胞都有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制。2/10/20233南京农业大学生命科学学院第七章基因的表达与调控（上）

细菌中所利用的大多数基本调控机制一般执行如下规律：一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。实际上，当我们说一个系统处于“off”状态时，也可能有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子和极少量的蛋白质分子。为了方便，我们常常使用“off”这一术语，但必须明白所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。2/10/20235南京农业大学生命科学学院第七章基因的表达与调控（上）内容：原核基因表达调控总论乳糖操纵子与负控诱导系统色氨酸操纵子与负控阻遏系统其他操纵子转录水平上其它调控转录后调控2/10/20236南京农业大学生命科学学院第一节原核基因表达调控总论 随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。 科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（geneexpression），对这个过程的调节就称为基因表达调控（generegulation，genecontrol）。

基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。2/10/2023南京农业大学生命科学学院7第一节原核基因表达调控总论2/10/2023南京农业大学生命科学学院9在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。转录与翻译的特点：细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联。真核生物中，转录产物只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。第一节原核基因表达调控总论2/10/2023南京农业大学生命科学学院101.原核基因调控分类原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor)。根据其作用特征又可分为负控诱导系统和负控阻遏系统二大类。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)。也可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。阻遏蛋白激活蛋白转录激活负控诱导正控诱导转录抑制负控阻遏正控阻遏2/10/2023南京农业大学生命科学学院11第一节原核基因表达调控总论2/10/2023南京农业大学生命科学学院132.原核基因调控的主要特点：原核生物通过特殊代谢物调节的基因活性主要分为可诱导和可阻遏两大类:可诱导调节。是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。这类基因中最突出的例子是大肠杆菌的乳糖操纵子。可阻遏调节。这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。比如大肠杆菌中的色氨酸操纵子。第一节原核基因表达调控总论2/10/2023南京农业大学生命科学学院143.弱化子对基因活性的影响在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段DNA序列被称为弱化子。属于这种调节方式的有：大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子和缬氨酸操纵子以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等等。第一节原核基因表达调控总论2/10/2023南京农业大学生命科学学院154.降解物对基因活性的调节有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院171961年，Jacob和Monod提出了操纵子模型，这是与特殊代谢途径有关的基因转录的协同调控模型。操纵子是基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括:结构基因（除调节基因以外的所有基因），编码那些在某一特定的生物合成途径中起作用的、其表达被协同调控的酶。调控元件，如操纵序列，是调节结构基因转录的一段DNA序列。调节基因，其产物能够识别调控元件，例如阻抑物，可以结合并调控操纵基因序列。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院18大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会被合成。大肠杆菌乳糖操纵子（lactoseoperon）包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院19P为启动子，O为操纵区，lacI编码阻遏子3个结构基因各决定一种酶：Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院211.酶的诱导——lac体系受调控的证据用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖1～2分钟后，编码β-半乳糖苷酶和透过酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，量立即下降。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院221.酶的诱导——lac体系受调控的证据实验室常用两种乳糖类似物——异丙基巯基半乳糖苷（IPTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用发色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院232.操纵子模型及其影响因子Jacob和Monod通过大量实验及分析，建立了现在已经被人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。内容如下：Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院252.1.lac操纵子的本底水平表达两个矛盾：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要转运酶，转运酶的合成有需要诱导。人们发现乳糖并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是异构乳糖，而后者是在β-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。解释：在没有诱导物的情况下，转运酶和β-半乳糖苷酶仍有本地水平的表达。阻遏物的结合并非绝对紧密，偶尔会掉下，使得转录可以进行。表达量足以使诱导过程得以启动。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院262.2.大肠杆菌对乳糖的反应在以甘油为碳源的培养基中加乳糖以前，lac操纵子本底水平表达加乳糖后，阻遏物失活，mRNA大量表达乳糖耗尽，阻遏物浓度逐渐大于异构乳糖，阻遏状态重新形成，mRNA水平下降。β-半乳糖苷酶半衰期长，其活性下降滞后。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院292.4.葡萄糖对lac操纵子影响某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lacmRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院302.5.cAMP与代谢物激活蛋白cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。2.5.cAMP与代谢物激活蛋白大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。CRP和cAMP都是合成lacmRNA所必需的，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导操纵子控制的，被称为降解物敏感型操纵子，由cAMP-CRP调控。2/10/2023南京农业大学生命科学学院312/10/2023南京农业大学生命科学学院32cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lacmRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院33P区（即启动子区）一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp。O区（即阻遏物结合区）位于-7～+28位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。3.lac操纵子的调控区域—P、O区第二节乳糖操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院34lac操纵子小结通常情况（葡萄糖供应正常）阻遏蛋白与操纵序列结合，基因不转录。细胞外的乳糖通过透性酶吸收到细胞内；细胞内的β-半乳糖苷酶将乳糖转变为异乳糖。异乳糖结合到乳糖阻抑物上使之从操纵序列上脱离，聚合酶迅速开始lacZYA基因的转录。这就是负控诱导。然而，还需要细菌生长系统中缺少葡萄糖，使cAMP含量增加，才有足够量的cAMP与CRP结合形成CRP-cAMP复合物结合于Plac上游。使DNA双螺旋发生弯曲，转录才可以有效地进行。第三节色氨酸操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院35trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。操纵子中各基因功能：trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的α和β亚基。在许多细菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。2/10/2023南京农业大学生命科学学院36第三节色氨酸操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院37trpE基因是第一个被翻译的基因，与紧邻的是启动子区和操纵区。前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。第三节色氨酸操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院381.trp操纵子的阻遏系统trpR基因突变常引起trpmRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白（aporepressor）。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并关闭trpmRNA转录。效应物分子色氨酸是trp操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子去阻遏。2/10/2023南京农业大学生命科学学院39第三节色氨酸操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院402.弱化子与前导肽在trpmRNA5’端有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中123～150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为弱化子，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。第三节色氨酸操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院412.弱化子与前导肽前导肽分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，能产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽。在前导序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。第三节色氨酸操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院422.弱化子与前导肽mRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。终止构型抗终止构型2/10/2023南京农业大学生命科学学院432.弱化子与前导肽mRNA前导区的序列分析RNaseT1降解实验（此酶不能水解配对的RNA）表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式，由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。2/10/2023南京农业大学生命科学学院442.弱化子与前导肽mRNA前导区的序列分析RNaseT1降解实验（此酶不能水解配对的RNA）表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式，由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行。2/10/2023南京农业大学生命科学学院452.弱化子与前导肽转录弱化作用培养基中色氨酸浓度低，负载有色氨酸的tRNATrp就少，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），前导区2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，转录继续进行。培养基中色氨酸浓度高，核糖体顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，3-4区自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。第四节其它操纵子2/10/2023南京农业大学生命科学学院46典型的操纵子和调控机制还有：半乳糖操纵子阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答二组分信号调控系统和信号转导多启动子的调控的启动子第五节转录水平上其它调控转录过程涉及转录机器附着与DNA，识别启动子序列，起始RNA的合成，延伸和终止。转录的任何一步都受到调控。转录水平上以下其它调控方式：σ因子的调节作用组蛋白类似蛋白的调节作用转录调控因子的作用抗终止因子的调节作用2/10/2023南京农业大学生命科学学院47第六节转录后调控2/10/2023南京农业大学生命科学学院48基因表达的转录调控是生物最经济的调控方式。但转录生成mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行“微调”，是对转录调控的补充，它使基因表达的调控更加适应生物本身的需求和外界条件的变化。调控方式有：mRNA自身结构元件对翻译起始的调控mRNA稳定性对转录水平的影响调节蛋白的调控作用反义RNA的调节作用稀有密码子对翻译的影响重叠基因对翻译的影响翻译的阻遏魔斑核苷酸水平对翻译的影响第六节转录后调控2/10/2023南京农业大学生命科学学院491.翻译起始的调控遗传信息的翻译起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）——起始密子AUG上游的一段非翻译区。在RBS中有SD序列，与核糖体16SrRNA的3’端互补配对，促使核糖体与mRNA相结合。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及与AUG的距离。SD与AUG相距一般以4～10核苷酸为佳，9核苷酸最佳。SD序列的微小变化，往往会导致表达效率成百上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成mRNA5’端二级结构的自由能，影响了30S亚基与mRNA的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异。第六节转录后调控2/10/2023南京农业大学生命科学学院502.mRNA稳定性对转录水平的影响所有细胞都有一系列核酸酶，用来清除无用的mRNA。一个典型的mRNA半衰期为2-3min。mRNA分子被降解的可能性取决于其二级结构。3.蛋白质的调控作用细菌中有些mRNA结合蛋白可激活靶基因的翻译。相反，mRNA特异性抑制蛋白则通过与核糖体竞争性结合mRNA分子来抑制翻译的起始。大肠杆菌中的核糖体蛋白就存在翻译抑制现象。第六节转录后调控2/10/2023南京农业大学生命科学学院514.反义RNA的调节作用RNA调节是原核基因表达转录后调节的另一种重要机制。细菌相应环境压力的改变，会产生一些非编码小RNA分子，能与mRNA中的特定序列配对并改变其构象，导致翻译过程的开启或关闭等作用。第六节转录后调控2/10/2023南京农业大学生命科学学院525.稀有密码子对翻译的影响dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内50个拷贝的dnaG蛋白，2800个拷贝的rpoD蛋白；40000个拷贝的rpsU蛋白。基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子。分别计算大肠杆菌中25种结构蛋白和dnaC、rpoD序列中64种密码子的利用频率，可以看出dnaG与其他两类有明显不同。5.稀有密码子对翻译的影响很明显，稀有密码子AUA在高效表达的结构蛋白及σ因子中均极少使用，而在表达要求较低的dnaG蛋白中使用频率就相当高。许多与dnaG一样含量少的蛋白，由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。2/10/2023南京农业大学生命科学学院53第六节转录后调控2/10/2023南京农业大学生命科学学院546.重叠基因对翻译的影响正常情况下，trp操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trpD产量比下游trpBA产量要低得多。研究trpE和trpD以及trpB和trpA两对基因中核苷酸序列与翻译的关系，发现trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始密码子共用核苷酸。trpE—苏氨酸——苯丙氨酸——终止ACU———UUC-———UGAuggcuAUG——GCU甲硫氨酸——丙氨酸——trpD6.重叠基因对翻译的影响由于trpE的终止密码子与trpD的起始密码重叠，trpE翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。trpB和trpA基因也存在着翻译耦联现象。实验证明，耦联翻译可能是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。大肠杆菌gal操纵子中也存在基因重叠现象。2/10/2023南京农业大学生命科学学院55第六节转录后调控7.翻译的阻遏8.魔斑核苷酸水平对翻译的影响鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）是在色谱上检出的斑点，当时称魔斑（magicspot）。（详见本PPT16页）2/10/2023南京农业大学生命科学学院56ThankYou!9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7NeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTl!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmt*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!tA2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9