地高辛标记及检测试剂盒说明书

免疫检测需要附加的试剂请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA酶和RNA酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M马来酸0.15MNaClpH7.5(20℃)0.3%(v/v)Tween2015-25℃,稳定去除未结合的抗体（膜的洗涤）马来酸缓冲液0.1M马来酸0.15MNaCl用NaOH(固体)调节pH值到7.5(20℃)15-25℃,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1MTris-HCl0.1MNaClpH9.5(20℃)15-25℃,稳定调整pH值到9.5（碱性磷酸酶的缓冲液）TE缓冲液10mMTris-HCl1mMEDTApH8.015-25℃,稳定终止颜色反应试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1：10的比例将10x封阻液（6号瓶按体积比10%溶解）稀释成1x工作溶液现配现用封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP（4号管）10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：5000（150mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP2-8℃，12h与地高辛标记的探针结合底物显色液取200gLNBT/BCIP（5号管）于10ml检测缓冲液中混匀注意：避光保存即配即用抗体结合的可视化

操作步骤此表描述了完成一张100cm2膜的免疫检测方法。注意：所有的孵育均是在15-25℃下，振荡完成的。如果膜还需要再次与探针杂交，那么任何时候都不要让膜干。步骤操作1杂交和严谨洗涤后，将膜简单的用洗涤缓冲液冲洗1-5分钟2在100mL封阻液中孵育30分钟3在20mL抗体溶液中孵育30分钟4用100mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟5在20mL检测缓冲液中平衡2-5分钟8将孵育膜放入盛有准备好的2面底物显色液的盒子中，避光。在显色过程中不能摇动。注意：几分钟后沉淀颜色开始形成，短时间内可适当打开盒子观察染色情况9当得到预期的斑点或者聚焦强度已经完成，则停止反应，用无菌双蒸水50ml或者TE缓冲液洗膜5min结果可以用影印湿过滤器或者摄影记录如果那么你想再探讨这块膜膜在任何时候都不能干掉，存储在密封塑料袋中你不想探讨干燥膜，储存在15oC-25oC注意：干燥后颜色变淡，为使颜色恢复，可用TE缓冲液润湿DNA印记的洗脱和再次探针杂交主要信息印记中的碱性标记形式的DIG-11-dUTP能够更容易更有效的被洗脱，以用于再一次的杂交实验。所需附加的仪器和试剂DMF2xSSC0.2NNaOH,0.1%SDS操作步骤此操作描述的是膜的洗脱。注意：如果计划印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能干。可选择的洗脱方法，用于filter杂交的地高辛应用操作手册中提到的（可以通互联网获得）步骤操作1用大烧杯水浴加热DMF到50-60℃将膜放入其中直到蓝色颗粒从膜上脱落双蒸水充分洗涤2在37℃条件下，用含有0.1%SDS的0.2MNaOH洗涤两次，每次20分钟，以去除地高辛标记的探针3用2xSSC充分洗涤5分钟