杨树植物组织培养

1、培养基及外源激素的选择

2、外植体

3、分化培养

4、生根培养

5、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第1页/共36页第一页，共37页。

杨树(Poplar)是重要的速生经济树种。扦插是杨树的传统繁殖方式，由于年龄效应，多代扦插后容易出现退化，通过脱毒复壮和杂交育种后，性状才能恢复。近年来生物技术的发展为杨树快繁和遗传改良开辟了广阔的前景。通过嫩枝、幼茎、嫩叶、叶柄、生长点和原生质体等的离体培养，可在短期内获得大量优质杨树苗木。第2页/共36页第二页，共37页。一.培养基及外源激素的选择

培养基的种类是影响组培苗生长的关键因素。目前，在杨树组织培养的过程中MS、1/2MS、WPM等培养基都有广泛的应用。MS与WFM培养基均属于高盐培养基，可以提供木本植物生长所需的盐类。1、培养基的种类第3页/共36页第三页，共37页。

张蕾等在京2杨再生体系建立的研究中提出，由于京2杨生长需要较高的营养，MS和WPM培养基明显优于GMS培养基，且MS培养基更适于腋芽的启动和生长。在35杨叶片不定芽诱导过程中，WPM培养基诱导芽迅速，芽发育正常且集中生长于切面大小叶脉处，各项指标均优于MS培养基。不同杨树的生长环境与生物学特性不同，导致适合其诱导、增殖及生根生长的培养基不同。所以，杨树组织培养时，不能片面评价培养基的优或劣。一.培养基及外源激素的选择第4页/共36页第四页，共37页。2.外源激素的选择

植物组织培养过程中，外源生长调节剂是影响培养物形态建成的主要因子，细胞分裂素主要用于促进细胞分裂和由器官或愈伤组织上分化不定芽，生长素则被用于诱导细胞的分裂和根的分化。在杨树的分化培养过程中，通常选用的细胞分裂素是6-BA、ZT、KT等，生长素为NAA。一.培养基及外源激素的选择第5页/共36页第五页，共37页。

康薇等对美洲黑杨叶片离体再生的研究中指出，不同细胞分裂素与0.02mg/LNAA配合诱导叶片不定芽，其效果差异明显，0.02mg/L6-BA分化率为91.1%,ZT次之，KT浓度小于0.2mg/L时只分化出根。。一.培养基及外源激素的选择第6页/共36页第六页，共37页。Wang等在对银中杨茎段的离体再生研究中指出，采用MS为基础培养基，附加较低浓度的TDZ，采用正常光和黄光为光源，有利于银中杨茎段不定芽的分化，而采用B5为基础培养基附加较高浓度的TDZ会对不定芽的分化产生抑制。将TDZ与6-BA配合使用效果明显优于单独使用，在新疆杨和河北杨叶片不定芽诱导的过程中添加与单独使用TDZ相比，河北杨与新疆杨叶片分化率分别增加了14.82%和25.00%。一.培养基及外源激素的选择第7页/共36页第七页，共37页。

陈伟纶等和诸葛强等的研究中也均发现此种现象。不同的细胞分裂素其作用机理不同，以一定比例配合使用，可以实现生物学的互补效应，有望在组织培养中产生更理想的效果一.培养基及外源激素的选择第8页/共36页第八页，共37页。二、外植体

任何具有完整细胞核的植物细胞都具有细胞全能性。研究发现，与茎尖分生组织接连的组织具有较强的形态发生能力。因此，外植体选取的原则为尽量选择幼嫩的部位，外植体越幼嫩，植株越容易再生。目前，国内外研究者均采用直接采集外植体或采用截取水培或沙培后长出幼嫩部分作为外植体的方式，进行离体快繁。1、外植体的选择第9页/共36页第九页，共37页。

沈周高等利用中林2001杨、南林95杨和南抗杨这3种黑杨杂种的叶片作为外植体，在产生的愈伤组织上成功诱导出苗。丁霞等诱导胡杨叶30d后产生大量丛生芽。张春霞等对滇杨叶柄进行10d的诱导后产生绿色芽点，30d时长出丛生芽。二、外植体第10页/共36页第十页，共37页。

易丽娟等利用中林美荷杨叶柄为外植体对其组织培养及植株再生进行研究并取得了成功。朱湘渝等利用BN、N6、MS等5种培养基诱导杨树花药，也成功诱导出了杨树单倍体植株。但于志水等在研究中指出水培苗的茎尖容易褐化，不易作为外植体。二、外植体第11页/共36页第十一页，共37页。

从上述研究结果的诱导时间来看，茎段所需时间最短，叶片与花药所需时间较长。实践证明，杨树组织培养中，腋芽、茎尖、叶片均为较好的外植体材料。二、外植体第12页/共36页第十二页，共37页。2、外植体的消毒二、外植体

在杨树无菌体系的建立中，外植体常用乙醇、次氯酸钠、氯化汞、双氧水和吐温等作为消毒剂。叶片通常先采用70%-75%乙醇处理10-60s再用HgCl2处理3-8min或次氯酸钠处理2-10min,茎段、茎尖和腋芽在消毒中通常选用乙醇消毒30-60s,再用滴加1-2滴叶温的HgCl2溶液处理5-15min。第13页/共36页第十三页，共37页。

沈周高等对3种黑杨杂种叶片进行不同时长的消毒处理，结果表明，0.1%Hgcl2溶液消毒4min为最佳处理，叶片污染率为20%，出愈率为76%。

金顺玉等利用叶片作为外植体，用75%乙醇消毒1min附加NaClO消毒2min即获得了无菌苗。二、外植体第14页/共36页第十四页，共37页。

研究发现，将杨树半木质化新稍浸泡在蒸馏水中30min使其吸饱水分，可以减少HgCl2对其内部细胞组织的侵害。一般情况下，从优树上直接截取的外植体通常需要较复杂的消毒手段和较长的消毒时间，而茎尖与茎段等部位消毒时间长于叶片。另外，对于花粉、子房、未成熟种子等多层包被的微小材料，为了不影响生长，可不经消毒。二、外植体第15页/共36页第十五页，共37页。三、分化培养

在杨树组织培养过程中，不同类型的外植体经过人工诱导，都能够重新开始细胞分裂与器官分化，长出根、芽等器官，最终形成完整植株。不同部位的外植体的大小及摆放方式直接影响杨树组织培养的分化率及成活率。第16页/共36页第十六页，共37页。

王树耀等指出84K杨树叶的不同着生部位和同一叶片的不同切块均对不定芽的诱导有影响，从第1片叶到第5片叶不定芽诱导总数递减，叶片上切段、中切段、下切段不定芽的诱导率分别为12.0%、13.3%、73.3%，不同切段不定芽诱导率存在显著差异，这可能是由于内源激素水平不同引起的。三、分化培养第17页/共36页第十七页，共37页。

沈周高等在研究了3种黑杨杂种叶片不同放置方式诱导愈伤后指出，叶片放置方式对于愈伤组织的诱导有显著影响，叶片正面向上的诱导率明显高于向下的。但在对胡杨的研究中，叶片不同放置方式对于分化培养差异不大，这可能是由于不同的材料其表皮上气孔的数目、分布均不同，而这种差异导致叶片在离体条件下对营养成分的吸收与利用不同。三、分化培养第18页/共36页第十八页，共37页。

研究还表明，采用畸形、浅绿、皱缩叶片作为外植体培养，将直接影响叶片的诱导过程，生长速度缓慢，难以成苗。宋玉霞等在进行银河1号杨树叶外植体再生体系建立的研究中指出，利用无菌生根试管植株叶片作为外植体，在分化时间、分化率、分化芽数方面均优于无菌无根试管植株叶片。茎段诱导培养中通常采用1cm大小的外植体，较容易诱导出芽。三、分化培养第19页/共36页第十九页，共37页。四、生根培养

杨树的生根培养大都采用1/2MS为基础培养基，附加一定量的NAA,lAA,IBA。汪建亚等在山地杨的快速繁殖研究中指出，以1/2MS为基础培养基附加时，生根率达100%，但添加lAA后进行生根培养时，效果普遍较差。林元震等在甜杨的组织培养和快速繁殖研究中指出，采用1/4改良MS+0.1mg/LIBA+0.1mg/LNAA;进行生根培养，生根率可达100%，根短而粗，根数多。第20页/共36页第二十页，共37页。

史绍林等在新西伯利亚银白杨的根诱导过程中发现，IBA与NAA配合使用效果明显优于单独使用，两者配合使用时NAA浓度应高于IBA浓度，但NAA浓度过高易产生大块愈伤。当采用1/2MS+0.1mg/LNAA+0.02mg/LIBA作为根诱导培养基配方时，生根率达90%，根数多，生长健壮。四、生根培养第21页/共36页第二十一页，共37页。

史绍林等在山新杨的组培育苗过程中，采用了简化生根培养，在生根培养基中用一定比例的蛙石、草炭土、珍珠岩替代琼脂，用过滤自来水替代蒸馏水，混合培养基污染率儿乎为零，生根率达96%。后者有望替代传统生根培养，以获得更多高质量、高成活率的杨树幼苗。四、生根培养第22页/共36页第二十二页，共37页。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法1、褐变现象褐变概念：褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。第23页/共36页第二十三页，共37页。克服外植体褐变措施：（1）选择适当的外植体选择生长旺盛的，分生能力强的部位作为外植体材料，在进行组织培养过程中不易产生褐变。（2）培养材料进行预处理将外植体用流水冲洗后，在5℃左右处理12~24h，消毒后先接种在只含有蔗糖的培养基上5~7d，使组织中的酚类物质部分先渗入培养基。取出外植体，用适当方法清洗，再接种到适合的培养基上，可减轻外植体的褐变。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第24页/共36页第二十四页，共37页。（3）选择适当的培养基和培养条件在培养基的选择上应注意适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平与组合以及配合一些抗褐变剂等都可减轻褐变现象的发生。培养过程中还要注意适宜的培养条件，因为在酚类物质的合成和氧化过程中，有许多酶系统参与，其中部分酶系统是光活性的。较高的温度会使酶促褐变加强。所以建议在培养初期保持较低的温度(15-20℃)，黑暗或弱光下培养，均可减轻培养材料的褐变。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第25页/共36页第二十五页，共37页。2.污染的原因及对策

污染是指在植物组织培养过程中，培养基和培养材料滋生杂菌，最终导致培养失败的现象。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第26页/共36页第二十六页，共37页。（1）细菌污染及对策细菌性污染的主要症状是材料附近出现载液状和发酵泡沫状物体，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在接种后1-2d即可发现。外植体带菌污染的解决措施是对外植体进行彻底消毒。即根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法;对特殊材料先进行预处理;对材料内部带菌的组织，在培养基中加入适量抗生素，以达最佳消毒效果。此外，培养基的灭菌力求彻底，而且操作人员要严格按照无菌操作顺序操作。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第27页/共36页第二十七页，共37页。（2）真菌污染及对策真菌性污染主要指霉菌引起的污染，一般接种后3-8d可在培养基中发现各种颜色的菌斑。多由空气污染和瓶口边缘以及取放封口纸扬起的灰尘和真菌抱子落入器皿中造成。因此，每次使用接种室和超净工作台前，先用紫外线灯杀菌20min，再用75%的酒精喷雾降尘。接种时先用75%的酒精棉球擦拭瓶子外部，然后再放入超净台。接种时，瓶子要拿成斜角，瓶口放在火焰上方，利用气流上升的原理，以阻止空气中飘扬的抱子落入瓶内，取封口纸时动作要轻。另外，如发现霉菌污染应及时清除。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第28页/共36页第二十八页，共37页。（3）内源菌污染及对策在植物组织培养过程中，较难处理的是内源菌污染。内源菌污染是由于外植体材料内部的微生物(如内生细菌、真菌等)不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程造成的。针对内源菌污染，有以下防治对策:①改进外植体消毒方法。②反复检查培养物。③使用抗生素。抗生素能抑制污染菌的生长，在使用初期效果较好。但抗生素不能完全杀死污染菌，因此潜伏的污染可能会给植物以后的生长带来问题。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第29页/共36页第二十九页，共37页。玻璃化概念：玻璃化是指在培养过程中材料呈半透明状，组织结构发育畸形的现象，又称“过度水化“。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法3、玻璃化现象第30页/共36页第三十页，共37页。（1）玻璃化防治对策利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，可降低玻璃化。琼脂浓度应不低于0.8%，条状琼脂先用双蒸水浸泡24h去除杂质，粉状琼脂应尽可能选用含灰量低于2.5%的琼脂粉。因为琼脂杂质中的Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2十、Cu2+等含量较高，会影响培养基中矿质元素的含量和比例。五、杨树组织培养中应注意的问题及其解决方法第31页/共36页第三十一页，共37页。

玻璃化发生是“生长因子不平衡的产物”、是培养物“中毒”、不能很好适应培养基和培养环境的结果。因而提高培养物对逆境的耐受能力是有益的。可适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，