液相色谱培训

液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用

气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力

液相色谱基础知识第1页/共40页第一页，共41页。一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱液相色谱基础知识俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素.第2页/共40页第二页，共41页。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。第3页/共40页第三页，共41页。慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液第4页/共40页第四页，共41页。二、定义色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，色谱柱固定液液相色谱基础知识第5页/共40页第五页，共41页。高效液相色谱法的特点一、高压

液相色谱以液体作为流动相（称为载液），液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，一般可达到150～300kg／cm2，甚至可达700k／cm2以上。第6页/共40页第六页，共41页。二高速

高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达l—10mL／min，

个别可高达100mL／min以上，这已近似于气相色谱的流速。

三高效

气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达

60000理论塔板／米；第7页/共40页第七页，共41页。四高灵敏度

紫外检测器的最小检测量可达毫微克数量级(10-9g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行全分析。

第8页/共40页第八页，共41页。一、固定相和流动相常用的流动相：水、甲醇、乙腈等。流动相的选择：样品和流动相应具有化学上的相似性。流动相的过滤：用孔径为0.45μm滤膜过滤除去固体颗粒杂质。

流动相过滤器

样品过滤器

第9页/共40页第九页，共41页。液相色谱基础知识采用“HPLC”

级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择第10页/共40页第十页，共41页。溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率第11页/共40页第十一页，共41页。溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱第12页/共40页第十二页，共41页。第13页/共40页第十三页，共41页。液相色谱基础知识液相色谱流程图溶剂输液泵进样器柱温箱检测器数据处理第14页/共40页第十四页，共41页。§3-3高效液相色谱仪基本结构一、高效液相色谱仪基本组成输液系统进样系统分离系统检测系统色谱数据处理系统；第15页/共40页第十五页，共41页。§3-3高效液相色谱仪基本结构一、输液系统滤头贮液瓶第16页/共40页第十六页，共41页。§3-3高效液相色谱仪基本结构二、进样系统手动进样器自动进样器第17页/共40页第十七页，共41页。§3-3高效液相色谱仪基本结构三、分离系统色谱柱第18页/共40页第十八页，共41页。柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

液相色谱基础知识第19页/共40页第十九页，共41页。柱压低于150kgf/cm2柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃缓冲液PH使用范围为2～7ODS柱的使用注意点：硅胶在PH为3～4时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。液相色谱基础知识第20页/共40页第二十页，共41页。硅胶基底聚合物基底pH范围2-7.5宽范围有机溶剂所有有限制压力〈250kgf/cm2低压温度宽范围〈60C液相色谱基础知识色谱柱的类型及适用范围第21页/共40页第二十一页，共41页。§3-3高效液相色谱仪基本结构四、检测系统紫外检测器蒸发光散射检测器二极管阵列检测器荧光检测器第22页/共40页第二十二页，共41页。原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比尔定律，A＝ECL优点：1）灵敏度高

2）对温度和流速不敏感

3）可用于梯度洗提缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器第23页/共40页第二十三页，共41页。过滤：0.45um或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

气泡对测定的影响：

1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积

2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形

3）检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意：

1）每天脱气

2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶剂前处理第24页/共40页第二十四页，共41页。液相色谱基础知识梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）第25页/共40页第二十五页，共41页。1.使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀

2.进样前最好使用0.45um的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样品处理第26页/共40页第二十六页，共41页。GeneralMaintenanceandTroubleshooting缓冲液的使用

使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:

用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min易受到细菌和霉菌的影响

不能直接用有机溶剂冲洗第27页/共40页第二十七页，共41页。进样器自动进样器手动进样器原理：（六通阀）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入液相色谱基础知识第28页/共40页第二十八页，共41页。手动进样器的原理图

装填状态液相色谱基础知识进样状态第29页/共40页第二十九页，共41页。2、进样系统 通常采用六通伐进样：色谱柱色谱柱泵泵12进样第30页/共40页第三十页，共41页。手动进样法

1.进样状态下插入微量注射器

2.切到装填状态

3.注入样品

4.切回到进样状态第31页/共40页第三十一页，共41页。常用检测器紫外检测器（包括二极管阵列检测器）荧光检测器示差折光检测器电导检测器液相色谱基础知识第32页/共40页第三十二页，共41页。液相色谱基础知识反相液相色谱

流动相极性大于固定相极性能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物正相液相色谱

流动相极性小于固定相极性不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC第33页/共40页第三十三页，共41页。§3-4定性定量分析一、定性分析定性依据：保留时间（tR），即在相同条件下，供试品溶液（样品溶液）所显示的主峰保留时间与对照品一致；第34页/共40页第三十四页，共41页。色谱基本参数与流出曲线的表征1.基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值

（1）时间表示的保留值保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；第35页/共40页第三十五页，共41页。3、分离度第36页/共40页第三十六页，共41页。定性定量分析混合标品溶液样品溶液第37页/共40页第三十七页，共41页。§3-4定性定量分析二、定量分析定量依据：朗伯-比尔定律（A=kc）由A=kcA标/A样=c标/c样方法：外标法、标准曲线法外标法：A标/A样=c标/c样第38页/共40页第三十八页，共41页。§3-4定性定量分析二、定量分析标准曲线法（P91）

12345样品

C标

C1C2C3C4C5CXA标

A1A2A3A4A5AXACXAXCA1A2A3A5A4C2C1C3C5C4第39页/共40页第三十九页，共41页。感谢您