级五年制实验课酶联免疫吸附试验

2009级五年制本科生

免疫学实验课王慧文酶联免疫吸附试验(ELISA直接法)实验内容一、酶联免疫吸附试验(ELISA)直接法-测酶标抗体的效价二、免疫标记技术的基本原理、类型及应用实验目的

掌握ELISA直接法的操作过程。掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。实验原理示意图包被抗原实验材料

试剂：封闭液 6ml洗液(PBS-Tween20)1瓶样品稀释液(PBS)4.5ml兔血清(已包被)酶标抗体(HRP-Ab)1.5ml底物4.5ml终止液(H2SO4)2ml器材：酶标板(已包被)

1块锡纸1张200lpipette1把Tip若干试管7支1ml吸管(配胶帽)

1支培养箱43℃1台/室吸水纸若干记号笔1支包被：用0.05MPH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(正常兔血清)稀释至蛋白质含量为10g／ml。100l/well加入聚苯乙烯板酶标板中，4℃overnight。次日，弃去孔内溶液。封闭：150l/well封闭液,43℃40min，弃去封闭液。加样：加倍比稀释的酶标抗体(驴抗兔IgG)，100l/well分别加到对应的板孔内，置43℃孵育40mins。洗板三次。稀释方法与加板方法

加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的OPD底物溶液100l/well，室温下避光显色。终止反应：加50l/well

2M硫酸(终止液)。(改变PH值)结果判定：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的酶标抗体的稀释度为该抗体的效价。实验步骤

抗体稀释及加样方法500l样品稀释液女女500lE-Ab第1列：阴性对照（Ag-/Ab+）第2列：阴性对照（Ag+/Ab-）第10列：空白对照（Ag-/Ab-）

1.准备7个稀释管，做好标记。2.先在每个稀释管中加入稀释液500ul。3.取出500ul抗体加入第一管，混匀后，取出500ul加入第二管，依此类推至最后管。PBS1:21:41:81:161:321:641:128①②③④⑤⑥⑦原液包被固相支持物：聚苯乙烯和聚氯乙烯有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特性，被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变（Ag-Ab结合）包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（pH＝9.6）磷酸盐缓冲液（pH＝7.2）Tris-HCL缓冲液（pH＝7-8）包被温度、时间：4℃

18-24小时包被抗原浓度：10ug/ml封闭的作用包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止非特异性吸附，影响结果的准确性。如图：CoatingBlocking封闭的作用EEEAfterblockingAfterblockingEEEWithoutblockingEE最常用的封闭剂：0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA）10%的小牛血清1%明胶洗液（PBS-T）

磷酸盐缓冲液：（PBS）吐温20（Tween20):非离子型表面活性剂抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面标记抗体常用的酶辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。显色原理常用的供氢体：

邻苯二胺

OPD四甲基联苯胺TMBABTSDH2+H2O2HRPD+2H2O（底物）OPD（邻苯二胺）OPD氧化后的产物呈明黄色，用酸终止酶反应后，由橙红色转向棕黄色，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配现用。TMB（四甲基联苯胺）TMB经HRP作用后其产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。酶反应用HCL或H2SO4终止后，产物由蓝色变成黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。TMB有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。注意事项加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，避免出现气泡。加样器头不能混用，尤其是吸酶和底物时，一定要换加样器头。底物应现用现配。空白对照孔与阴性