表达传染性喉气管炎病毒gB主要抗原表位区域重组新城疫病毒的构建

目录摘要背景介绍材料方法结果12345讨论摘要

为构建以新城疫病毒(NDV)为活病毒载体表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB主要抗原表住区域的重组病毒,本研究以ILTVLJS09株的DNA为模板，通过PCR技术扩增1323bp

ILTV编码gB主要抗原表位的基因片段(1bp～440bp)，将其插入到NDV感染性克隆pBR-FL中,构建含有ILTVgB主要抗原基因的NDVcDNA克隆pBR-FL-gB1-440。利用磷酸钙转染法，在辅助质粒pcI-neo-NP、pcI-neo-P和pcI-neo-L的共同作用下,将重组质粒转染于表达T7聚合酶重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞，获得重组病毒rL-gB1-440。

采用RT-PCR检测接种重组病毒的鸡胚尿囊液，结果表明重组病毒中含有相应的外源基因。利用gB的抗血清检测重组病毒中gB的表达，间接免疫荧光试验表明，在感染重组病毒的BSR-T7/5细胞中目的蛋白得到表达。本研究为研制和开发传染性喉气管炎重组新城疫二联活疫苗奠定基础。摘要gB蛋白

糖蛋白gB是ILTV主要的囊膜糖蛋白，由883个氨基酸组成。gB对病毒的吸附、穿入及细胞间传播具有重要作用。此外，该蛋白能够诱导机体产生有效的免疫反应，属于ILTV的主要保护性抗原NDV作为病毒载体应用优点1、NDV具有不分节段单股负链RNA，遗传相对稳定，仅有一个血清型，病毒株间发生重组及毒力返强可能性很小2、由于NDV复制过程为RNA到RNA，并在胞浆内完，不存在DNA阶段及与细胞基因组整合的可能3、NDV疫苗可以同时诱导体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式进行免疫4、NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成品低背景介绍

鸡传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒引起的一种急性、接触性上部呼吸道传染病。其特征是呼吸困难、咳嗽和咳出含有血样的渗出物。剖检时可见喉部、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。在病的早期患部细胞可形成核内包涵体。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展。鼻窦肿胀，腔内有粘液喉头肿胀，气管内的血痰主要实验材料1、ILTVLJS092、表达T7聚合酶的重组痘病毒VTF-33、NDV感染性克隆pBR-FL4、稳定表达T7聚合酶的BSR—T7／5细胞系、LMH细胞系5、表达辅助核蛋白(pcI-neo-NP)、磷蛋白(pcI-neo-P)和大聚合酶蛋白(pCI-neo-L)的重组质粒6、抗ILTVgB的多抗血7、9日龄sPF鸡胚构建PBR-FL-gB1-400重组质粒扩增gB目的基因引物设计构建PBR-FL质粒转染RT-PCR

间接免疫荧光实验

技术路线实验方法引物设计与合成

根据GenBank中登录的ILTV

LJS09基因序列设计用于扩增gB主要抗原表位区基因的引物Pl/P2，序列为：5-GCGTTTAAACttagaaaaaaTacggagaaCgccaccATGCAATCCTACATCGCCGTGAACATTGAC-3’5'CGGTTTAAACTTTAGCTTGGCGACGCTCTCTCCcTCTCGG-3’.引物加下划线部分为引入的PmeI酶切位点，小写字母分别为加入的基因终止信号和基因起始信号，小写斜体部分表Kozark序列。目的基因的扩增及感染性cDNA克隆的构建

用DNA提取试剂盒提取感染ILTVLJS09的LMH细胞的病毒DNA，以提取的ILTVLJS09基因组DNA为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增。反应条件：PCR产物经1％凝胶电泳检测，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，得到的目的片段命名为gB1-400。将gB1-400片段进行PmeI酶切，回收纯化gB1-400基因片段克隆于经PmeI酶切的NDV感染性克隆pBR-FL中，构建含有gB1-400基因的NDV感染性克隆,通过PCR验证，筛选出正向连接的阳性重组质粒，命名为PBR-FL-gB1-400重组病毒的拯救将痘病毒VTF-3感染生长至50％～80％的BSR-T7/5胞．参照磷酸钙转染试剂说明书将pBR-FL-gB1-440以及pcI-neo-NP、pcI-neo-P、pcI-neo-L共转染BSR-T7/5细胞。转染24h后换成无血清的培养基并加入阿拉伯糖苷和TPCK，37℃继续培养72h，收获培养物上清液，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔。第5d收获尿囊液进行NDV的血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)。收获HA和Hl均呈阳性结果的尿囊液，其中含有拯救的重组病毒将拯救的重组病毒命名为rL-gB1-400重组病毒中gB1-440基因片段的检测将rL-gB1-440在9日龄SPF鸡胚连续传20代，每隔5代按照RNA提取试剂盒说明书提取尿囊液RNA。以RNA为模板，以Pl/P2为引物，进行RT-PcR扩增，以鉴定rL-gB1-440中是否含有gB1-440基因。重组病毒gB1-440基因表达的检测

分别将rL-gB1-440F3代和Lasota按照MOI约为1感染生长于6孔板的BSR-T7/5细胞，37℃培养至细胞病变(CPE)出现，经预冷的80％丙酮在4℃固定20min，以抗gB抗体为一抗，以羊抗兔IgG-FITc为二抗，进行间接免疫荧光(IFA)检测，荧光显微镜下观察鉴定结果。重组病毒的生长动力曲线将拯救病毒rL-gB1-440，与亲本病毒的尿囊液按照100EID50

/0.1mL接种量分别接种SPF鸡胚尿囊腔，于接种后24h、48h、72h、96h取样，每个时间点随机抽取3枚鸡胚，收集尿囊液混匀后分别测定其EID50绘制生长动力学曲线。结果

gB1-440基因的扩增结果以提取的ILTVLJS09基因组DNA为模板，以P1/P2特异性引物进行PCR扩增，其产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段约为1300bp，与预期相符.重组病毒中外源目的基因的检测及稳定性鉴定以rL-gB1-440感染的5代、10代、15代、20代的鸡胚尿囊液提取的病毒RNA为模板，RT-PCR扩增得到约l300bp片段，而NDVLasota株感染的鸡胚尿囊液中未扩增出任何的片段，表明gB1-440基因在rL-gB1-440中传代多次仍具有遗传稳定性将rL-gB1-440与LaSota分别感染BSR-T7/5细胞，待出现CPE时进行IFA检测。结果显示rL-gB1-440感染细胞在以兔抗gB血清为一抗的细胞孔内呈阳性荧光反应，而Lasota感染的细胞以及正常细胞均呈阴性反应.重组病毒的生长动力学曲线将重组病毒rL-gB1-440与亲本病毒分别按照100EID50/0.1mL接种于9日龄SPF鸡胚，感染24h、48h、72h、96h时分别收取病毒尿囊液，计算病毒滴度绘制动力学曲线。结果显示，rL-gB1-440的生长动力学曲线与亲本病毒相似，病毒滴度在相同时间达到了峰值，基本保持了亲本病毒在SPF鸡胚中的生长特性讨论目前，防制ILTV主要措施为使用弱毒疫苗但弱毒疫苗主要存在以下的不足(1)疫苗病毒株的毒力与免疫原性呈正相关，现有疫苗的毒力偏强，接种反应大(2)弱毒疫苗能够引起潜伏感染，潜伏感染的鸡群将终生带毒(3)疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，并且在鸡群与鸡群的传播过程中存在毒力返强的风险(4)目前仍无有效的鉴别强毒株和弱毒株的方法。因此，研究新型安全有效的疫苗用于防控ILTV尤为重要。

研究表明插入ILTV完整gB基因的重组NDV不能完全保护ILTV的攻击，推测可能是由于不充分的囊膜包裹以及细胞表面外源蛋白表达使得病毒不能诱发较强免疫诱导。同时，研究还显示，外源蛋白的插入表达降低NDV的致病力，其影响程度取决于插入基因的性质和长度因此，本研究在现有的NDVrLasota疫苗株反向遗传操作技术的基础上