甲状腺结节穿刺标本中BRAF V600E突变检测的临床意义

甲状腺结节穿刺标本中BRAFV600E突变检测的临床意义张玲;周晓燕;陈颖;张皓;高丽丽;王宇;稽庆海;平波;朱晓丽【摘要】背景与目的:在甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)中,BRAFV600EBRAFV600E(fine-needleaspirationcytology,FNACBRAFV600EBRAFV600E20166-20174563BFNACBRAFV600EQIAampDNAMiniKitDNA,并用突变特异性扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMSBRAFV600E:563FNAC,ARMS99.31.0:3.7,平均年龄(45.0±0.9)209PTC86.6100.0BRAFV600EPTC92.1100.0％.FNACBRAFV600EPTC11BRAFV600E9PTC.结论:ARMSFNACBRAFV600EBRAFV600E【期刊名称】《中国癌症杂志》【年(卷),期】2019(029)003【总页数】5页(P178-182)【关键词】甲状腺乳头状癌;细针抽吸细胞学检测;BRAFV600E突变检测【作者】张玲;周晓燕;陈颖;张皓;高丽丽;王宇;稽庆海;平波;朱晓丽【作者单位】200032200032【正文语种】中文【中图分类】R736.1甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率近年来快速上升［1］。目前，甲状腺细针抽吸细胞学检查（fine-needleaspirationcytology，FNAC）以其微创、易行及准确率高的特点，成为临床上诊断甲状腺结节良恶性最常用的方法，但仍有20%的病例无法明确诊断［2］。在甲状腺乳头状癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）中，BRAFV600E突变是迄今报道最多的突变类型［3-5］。检测B超引导下甲状腺结节穿刺细胞中的BRAFV600E突变可辅助细胞学诊断，提高诊断的灵敏度和准确率。突变特异性扩增系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）方法利用特异性引物和双环探针技术，将BRAFV600E检测灵敏度提高到1%的突变比例，大幅提高了检出率。本研究使用该方法对甲状腺穿刺细胞液进行BRAFV600E突变检测，以组织病理学诊断为金标准，评估BRAFV600E检测与细胞学诊断的灵敏度和特异度。材料和方法材料研究对象20166—20174B563BRAFV600E主要试剂与设备QIAampDNAMiniKit试剂盒购自德国QIAGEN公司，人类BRAFV600E突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。Eppendorf5810R低速离心机购自德国EppendorfAG公司，Thermo-Shaker恒温金属浴购自美国ThermoFisherScientific公司，QIAcube核酸提取仪购自德国QIAGEN公司，ThermoNANOdrop2000核酸浓度测定仪购自美国ThermoFisherScientific公司，ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应（real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RTFQ-PCR）LifeTechnologies方法DNA穿刺细胞液用Eppendorf5810R低速离心机4000r/min离心30min，去上清液，吸取沉淀加入裂解液放入Thermo-Shaker恒温金属浴56℃消化过夜。用QIAcube核酸提取仪提取DNA，用ThermoNanoDrop2000核酸浓度测定仪进行定量，并将浓度统一稀释至2ng/μL。RTFQ-PCRRTFQ-PCR35μL8DNA5μL4000r/min15～20sABI7500RTFQPCRRTFQ-PCR：955min，1（第一阶段）；9525s，64℃20s，72℃20s，15个循环（第二阶段）；93℃25s，60℃35s，72℃20s，31个循环（第三阶段）。信号收集：第三阶段60℃时收集突变FAM和内控HEX（或VIC）信号，执行RTFQ-PCR，保存文件。BRAFV600EThresholdFAMHEX（VIC）CtHEX（VIC）Ct13～21Ct21HEXRTFQ-PCRDNADNAFAMCt28，该样BRAFV600ECt13，说明加DNADNAFAMCt28BRAFV600EFAMCt20，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波FAMCt≥28，则样本为阴性（或低于试剂盒的检测下限）；FAMCt28，则样本为阳性。统计学处理采用SPSS19.0统计学软件对数据进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。2结果在563例进行BRAFV600E突变检测的患者中，男女比例为1.0∶3.7（120∶443），年龄1～79岁，平均年龄（45.0±0.9）岁（表1）。BRAFV600E检测成功率为99.3%（559/563），4例检测失败，无法判断结果（ARMS方法检测无HEX峰升起，提示扩增失败），BRAFV600E的总体突变率为50%。将标本按细胞学诊断分为6级，其中良性32例，未见肿瘤细胞182例，4296PTCPTC292例。表1甲状腺结节FNAC标本中BRAFV600E突变检出率、细胞量及DNA浓度Tab.1BRAFV600Emutation,cellnumberandDNAconcentrationintheFNACsamplesofthyroidnoduleCytologicaldiagnosisNGender(male∶female)Age/yearCellnumber＞60DNAconcentrationρB/(ng·μL-1)BRAFV600EmutationBenign326∶2623-61(mean46.0±3.1)71.4%(15/21)1.5-21.9(mean7.3±1.9)3.2%(1/31)Tumorcellsundetermined18231∶15119-80(mean48.0±1.6)28.3%(34/120)1.2-115.3(mean7.0±1.6)7.7%(14/181)Atypicallesions4210∶3227-67(mean46.0±3.1)50.0%(16/32)1.1-25.8(mean6.2±1.7)33.3%(14/42)Individualatypicalcell90∶926-52(mean39.0±6.2)40.0%(2/5)2.4-10.2(mean5.2±2.4)66.7%(6/9)Suspiciousforafollicularneoplasm61∶531-46(mean38.0±9.8)50.0%(3/6)1.6-17.4(mean9.1±6.9)40.0%(2/5)PTC/suspiciousforPTC29272∶22016-79(mean43.0±1.3)85.3%(174/204)1.1-85.7(mean9.0±1.1)82.1%(239/291)Total563120∶44316-79(mean45.0±0.9)62.9%(244/388)1.1-115.3(mean7.3±0.8)50.0%(280/559)388例FNAC标本做细胞量评估，样本总体均数可信区间为95%，细胞量评估＞60DNA（9.0±1.2）ng/μL，细胞量评估＜60DNA（6.0±1.7）ng/μL，10ng/μLt（P＞0.05）。209BRAFV600EPTC86.6%，10010020.6%。BRAFV600E78.2100.0%，阳性预测值为100.013.7%。FNACBRAFV600EPTC92.1%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为30.4%（表2）。FNACBRAFV600EFNACBRAFV600E（P＜0.005）。PTC11V600E9PTC，2PTC，460，32BRAFV600ETab2ComparisonofcytologicaldiagnosisandBRAFV600EdiagnosiswithhistopathologicdiagnosisHistopathologicdiagnosisItemSensitivity/%Specificity/%MalignancyBenignFNAC+175086.6100.0-277BRAFV600E+158078.2100.0-447FNAC+BRAFV600E+186092.1100.0-1673讨论PTC80%［6］，近年PTCBRAFV600E异常，突变率为45%～80%［7-8］。BRAFV600E突变后可持续性激活Ras基因/丝苏氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶激酶/丝裂原活化蛋白激酶（Ras/serine/threonine-proteinkinase/mitogenactivatedproteinkinasekinase/mitogen-activatedproteinkinase，Ras/Raf/MAPKK/MAPK）信号通路促使甲状腺细胞增殖，使滤泡上皮细胞发生恶变，并可促进高分化乳头状癌细胞发展为低分化和未分化癌细胞［9］。目前甲状腺结节穿刺的细胞学诊断是术前良恶性诊断的重要手段，但是约20%的甲状腺FNAC标本细胞学无法明确诊断［10-13］，其恶性风险度为1.7%～6.6%［14］，该组患者常需要再次穿刺或易漏检。因此，有学者开始将分子检测应用FNACFNACARMSBFNACBRAFV600E99.3%，方法简便快速，适用于临床术前辅助诊断。本研究中，评估比较细胞量＞6060FNACDNA10ng/μL，差异无统计学意DNA4BRAFV600EDNAARMSDNA86.6BRAFV600E92.1BRAFV600EBRAFV600E11BRAFV600E9PTC，说明在微小PTCBRAFV600EDNAPTC，BRAFV600E漏检率。FNACARMSBRAFV600EBRAFV600EFNAC［参考文献］【相关文献】［1］ELISEIR,MOLINAROE,AGATEL,etal.Aretheclinicalandpathologicalfeaturesofdifferentiatedthyroidcarcinomareallychangedoverthelast35years?Studyon4187patientsfromasingleItalianinstitutiontoanswerthisquestion［J］.JClinEndocrinolMetab,2010,95(4):1516-1527.［2］张博茗,林元强,隋国庆,等.细针穿刺细胞学联合BRAFV600E基因突变检测在甲状腺结节诊断中的价值［J］.肿瘤影像学,2015,24(4):259-263.［3］PARKKS,OHYL,KICS,etal.Evaluationofthereal-QBRAFV600Edetectionassayinfine-needleaspirationsamplesofthyroidnodules［J］.JMolDiagn,2015,17(4):431-437.［4］GUERRAA,DICV,GARZIA,etal.DiagnosticutilityofBRAFV600Emutationtestinginthyroidnodulesinelderlypatients［J］.BMCSurg,2013,13(Suppl2):S37.［5］ZHUX,LUOY,BAIQ,etal.SpecificimmunohistochemicaldetectionoftheBRAFV600Emutationinprimaryandmetastaticpapillarythyroidcarcinoma［J］.JExpMolPathol,2016,100(1):2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