环境微生物学第七章节微生物的遗传变异

环境微生物学第七章节微生物的遗传变异1第一页，共七十一页，2022年，8月28日遗传性：亲代性状在子代重现，使其子代的性状与亲代基本上一致的现象。同其他生物一样，微生物有其固有的遗传性。微生物的遗传是在系统发育过程中形成的，系统发育愈久的微生物，其遗传的保守程度愈大，越不易受外界环境条件的影响。老龄菌遗传保守程度比幼令菌大，高等生物遗传保守程度比低等生物大。一、遗传的基本概念第二节微生物的遗传2第二页，共七十一页，2022年，8月28日二、遗传的物质基础及其存在形式遗传的物质基础一切生物遗传的物质基础是核酸（DNA）核酸的结构：双螺旋结构2.遗传物质在细胞内存在部位和方式（1）细胞水平DNA集中在核质体中。（真核微生物：细胞核）杆菌细胞内大多存在两个核质体，而球菌一般只有一个。第二节微生物的遗传3第三页，共七十一页，2022年，8月28日（2）细胞核水平原核微生物：无核膜包裹，呈松散无定型状态，核基团不与蛋白质结合。真核微生物：有核膜，DNA与蛋白质结合，形成染色体（genome）。核外染色体（能自主复制）：广义上讲称质粒（plasmid）第二节微生物的遗传4第四页，共七十一页，2022年，8月28日（3）染色体水平原核微生物：每一个核质体中只有一个裸露的、在光学显微镜下无法看到的环状染色体。真核微生物：往往有不同数目的染色体。酵母菌属（saccharomycs）17个。染色体的套数：只有一套相同功能的染色体时称之为

单倍体，有两套时称双倍体。（4）核酸水平绝大多数的微生物的遗传物质为DNA，只有部分病毒才是RNA。第二节微生物的遗传5第五页，共七十一页，2022年，8月28日（5）基因水平（功能单位）基因：一切具有自主复制能力的遗传功能单位。是一核酸片段，一般含有1000bp（碱基对）基因的分类调节基因（regulator）：控制结构基因的活性结构基因（structuregene）操纵基因（operator）启动基因（promotor）操纵子（operon）第二节微生物的遗传6第六页，共七十一页，2022年，8月28日

遗传密码：DNA上各个核苷酸的特定排列顺序。每个密码子有3个核苷酸顺序来决定。（7）核苷酸水平核苷酸腺嘌呤A鸟嘌呤G胞嘧啶C胸腺嘧啶T戊糖碱基磷酸核苷（6）密码水平（信息单位）（最低交换单位、突变单位）第二节微生物的遗传7第七页，共七十一页，2022年，8月28日质粒（plasmid）定义：游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，即cccDNA(circularcovalentlyclosedDNA)。多指原核生物。结构：具有超级螺旋结构，分子量106－108道尔顿(100－10000kbp)第二节微生物的遗传8第八页，共七十一页，2022年，8月28日9第九页，共七十一页，2022年，8月28日质粒的基本特性：可移动性：异种间转移GentherF.J.(1998):69种环境中的细菌中，38％能从实验室的细菌接受R因子。可整合性：可整合到染色体上可重组性可消除性第二节微生物的遗传10第十页，共七十一页，2022年，8月28日20世纪50年代在日本发现的一种质粒（从患痢疾但被抗生素治疗后的病人中分离出的痢疾志贺氏菌中），而且能把抗药性转移到E.coli。1）R因子－R质粒沙门氏菌属（Salmonalla）芽孢杆菌属（Bacillus）假单胞菌属（Pseudomonas）葡萄球菌属（Staphulococcus）曾发现R因子的细菌R因子在细胞中的数目1~2—几十个。对多种抗生素有抗性，也可作为基因载体。具有R因子的细菌在自然界中的存活率高。第二节微生物的遗传11第十一页，共七十一页，2022年，8月28日2）F因子（Fertilityfactor）/致育因子、性因子是E.coli中决定性别的质粒。62×106Da，94.5kbpF+F+F+F-接合（conjugation）特点：有时能够插入染色体，使染色体的长度增长。有F因子的细菌：F+雄菌没有F因子的细菌：F-雌菌第二节微生物的遗传12第十二页，共七十一页，2022年，8月28日3）降解性质粒二甲苯质粒：XYL（Xylene）辛烷质粒：OCT（Octane）甲苯质粒：TOL（Toluene）萘质粒：NAP（Napthalene）樟脑质粒：CAM（Camphor）水杨酸质粒：SAL（Salicylate）在环保中有重要的意义：超级工程菌的获得。含有能降解复杂物质的基因，从而使细菌能降解难降解有机物。大多在假单胞菌属中发现。

至今发现的主要降解质粒（以其所能分解的底物命名）第二节微生物的遗传13第十三页，共七十一页，2022年，8月28日4.细胞器DNA真核微生物中，染色体之外的遗传物质的另一种存在形式。与其他物质一起构成细胞器（如：叶绿体、线粒体等）主要特性：－结构复杂多样－功能不一－数目多少不一－自我复制－可消除性（一旦消失，后代细胞中不再出现）质粒和细胞器DNA的异同点？第二节微生物的遗传14第十四页，共七十一页，2022年，8月28日5.转座因子可在染色体不同部位之间移动的DNA片断插入序列：能插入染色体或质粒的许多位点，并能改换位点转座子：能插入染色体或质粒的不同位点的一般DNA序列，可以转移到不同的位点上，本身也可复制。大小位几个kb。第二节微生物的遗传15第十五页，共七十一页，2022年，8月28日第七章微生物的生长和遗传变异

第三节微生物的变异基因突变基因重组16第十六页，共七十一页，2022年，8月28日变异：任何一种生物，亲代和子代之间在生理、形态方面都有一定的差异，这种现象叫变异（个体形态、菌落形态、生理生化特性、代谢产物）第三节微生物的变异一、变异的基本概念17第十七页，共七十一页，2022年，8月28日细菌易变异：∵细菌繁殖快，又与外界环境接触面积大∴环境条件在短时期内对菌体产生大的影响，在受物理、化学因素影响后，易产生适应新环境的酶（诱导酶）等，从而改变原有的特性，即产生了变异。变异形态变异菌落形态变异生理生化特性变异变异不一定都有遗传性第三节微生物的变异18第十八页，共七十一页，2022年，8月28日有目的地控制微生物的生长条件，使其向人类需要的方向变异。在污水生物处理中称为驯化（acclimation、adaption）有毒有害废水、难降解废水处理：通过驯化，增强微生物的降解能力，提高处理效果。定向培育：第三节微生物的变异19第十九页，共七十一页，2022年，8月28日二、基因变异基因突变基因重组定义：微生物的遗传性状变化称变异基因突变（自发突变）

定义：DNA链上因碱基的缺乏、置换、插入而发生的碱基排列顺序的变化，从而导致表现型发生了可遗传的变化，这种现象叫基因突变（变异）。基因突变的类型点突变畸变第三节微生物的变异20第二十页，共七十一页，2022年，8月28日点变异：一个或数个碱基发生变化点突变碱基置换移码突变转换：AG,GGTT,T颠换AACC,G缺失：添加：ABCABCABABCAABCAB第三节微生物的变异21第二十一页，共七十一页，2022年，8月28日畸变缺失：添加易位：倒位：重复：插入：abcabcabcabcabcabcdefpqrdefpqrghighifdeghijkl*畸变：碱基片断发生变化第三节微生物的变异22第二十二页，共七十一页，2022年，8月28日细菌基因突变的特点

无定向性（不对应性）稀有性：频率低10－5～10－10

自发性独立性：各细胞、基因间的变异没有必要的联系稳定性：可遗传可逆性：回复突变（back/reversemutation）诱变性：诱变剂可大大提高突变率（10－105倍）自发突变、诱发突变（诱变）

诱变剂（mutagen）：亚硝酸、紫外线第三节微生物的变异23第二十三页，共七十一页，2022年，8月28日1）转化（transformation）供体的DNA片段（可在自然条件下产生）进入受体细胞内发生重组，受体细胞获得供体细胞的一部分遗传特性。无需细胞接触。细菌、放线菌、真菌中有转化现象。2、基因重组定义：两个不同性状的个体细胞（细胞水平），其中一个细胞（供体）DNA与另一个细胞的DNA融合，使基因重新排列遗传给后代，产生新的遗传性状，称基因重组。

第三节微生物的变异24第二十四页，共七十一页，2022年，8月28日25第二十五页，共七十一页，2022年，8月28日细胞核质粒F因子、降解性质粒可通过此形式传递。2）接合（conjugation)

细胞直接接触而进行的基因重组。大肠杆菌的接合是通过性纤毛（中空）进行的。第三节微生物的变异26第二十六页，共七十一页，2022年，8月28日27第二十七页，共七十一页，2022年，8月28日28第二十八页，共七十一页，2022年，8月28日3）转导（transduction）通过噬菌体携带而转移的基因重组，无需细胞接触。在自然界中比较普遍。噬菌体进入供体细胞宿主的核染色体被切断成熟与包装之际形成不带噬菌体自身DNA的噬菌体（假噬菌体）（完全缺陷噬体）与受体接触感染a.完全转导(completetransduction)第三节微生物的变异29第二十九页，共七十一页，2022年，8月28日b.局部转导(specializedtransduction)由部分缺陷的噬菌体把少数特定的基因携带到受体菌中，并获得转导的现象。第三节微生物的变异30第三十页，共七十一页，2022年，8月28日4）原生质体融合（protoplastfusion）

通过人为的方法使两个遗传性状不同的细胞的原生质体发生融合，得到同时具有双亲性状的、遗传稳定的融合子（fusion），该过程称原生质体融合。（20世纪70年代）31第三十一页，共七十一页，2022年，8月28日原核、真核高等植物、人体细胞

能进行原生质体融合的细胞非常广泛步骤：用脱壁酶去除细胞壁混合（加聚二醇PEG），或电脉冲促进融合培养，使之称为完整细胞鉴定特点：1）重组频率>10-1.（远远大于诱变育种）

2）不同属、科间亦可融合。第三节微生物的变异32第三十二页，共七十一页，2022年，8月28日第七章微生物的生长和遗传变异

第四节遗传工程基因工程遗传工程及其在环境污染控制中的应用33第三十三页，共七十一页，2022年，8月28日一、基因工程（Geneticengineering）20世纪50年代——遗传物质的研究20世纪70年代——基因工程诞生1.定义：用人为的方法把供体生物的DNA导入受体生物中，并在其中“安家落户”，进行正常的复制、表达，从而获新物种的一种育种技术。是一种分子水平上的基因重组技术。第四节遗传工程34第三十四页，共七十一页，2022年，8月28日①用人为的方法，把供体生物的DNA大分子提取出来；②在离体的条件下，用工具酶进行切割；③之后把它与载体（vector）的DNA分子连接起来；④然后与载体一起导入受体生物。2.步骤：第四节遗传工程35第三十五页，共七十一页，2022年，8月28日<1>目的基因的取得：

供体细胞中提取分离合成<2>载体的选择：对载体的要求

具有自我复制能力；能在受体细胞内大量增殖；最好只有一个限制性内切酶的切口（使供体DNA接合在一定位置上）；有一种选择性遗传标志，以便追踪。常用载体：细菌质粒、噬菌体。最常用：PBR322（抗四环素、青霉素性基因）。表达抗药性可以用选择性培养基检出它们。第四节遗传工程36第三十六页，共七十一页，2022年，8月28日<4>重组载体引入受体细胞最广泛被应用的是E.coli、Bacillussubtilis（枯草杆菌）。引入方法转化（质粒作载体）病毒感染<3>基因的体外重组内切酶处理载体形成缺口目的基因的切断两者混合在低温下（5～6°C）混合“退火”；目的基因缝补上载体的缺口（动力:氢键作用而相互吸引并形成共价结合)。第四节遗传工程37第三十七页，共七十一页，2022年，8月28日38第三十八页，共七十一页，2022年，8月28日3.基因工程在环境保护中的应用获得能同时分解多种污染物的新型菌种。

超级细菌耐汞质粒降解染料质粒工业上：高性能发酵微生物的育种、酶、抗生素的生产。农业上：

固氮菌的基因转移到根系微生物或直接给植物；把降解木质素分解酶的基因转移导酵母菌使之能利用稻草、枯杆等生产酒精；改良农作物。医疗上：遗传病的治疗等。第四节遗传工程39第三十九页，共七十一页，2022年，8月28日几点注意：基因工程的成果往往只是一株带有新性状的“工程菌”，只有通过微生物工程才能实现它的经济与社会效益。DNA供体主要来源于微生物。基因工程菌存在的问题：

安全性混合培养系中的生存性降解能力的安定性大规模培养技术第四节遗传工程40第四十页，共七十一页，2022年，8月28日第七章微生物的生长和遗传变异

第五节微生物的驯化与保藏微生物的驯化微生物的保藏与复壮41第四十一页，共七十一页，2022年，8月28日一、微生物的驯化时间t污染物浓度污染物的生物降解曲线（生物降解过程中污染物浓度随时间的变化）微生物的“驯化”现象“驯化”是获得高效微生物（群）的有效方法第五节微生物的驯化与保藏42第四十二页，共七十一页，2022年，8月28日1.驯化的定义(Acclimation,adaptation)一般：获得新的能力的过程（新的分解能力、抗有毒物质能力）狭义：获得新的降解能力的过程使微生物接触待分解的化合物，给予适宜的营养和环境条件，进行培养。驯化操作：第五节微生物的驯化与保藏43第四十三页，共七十一页，2022年，8月28日2.驯化的机理生物降解的必要条件：

有合成降解酶的基因能合成降解酶微生物浓度高、环境条件适宜可能性驯化：从不能满足以上三个条件，到满足三个条件的过程。∴驯化机理：①获得所需的基因（变异、基因重组）②降解酶的诱导或抑制作用的解除③降解微生物的的高浓度化（选择性繁殖）本质驯化表观驯化第五节微生物的驯化与保藏44第四十四页，共七十一页，2022年，8月28日1）新基因的获得：突变：频率低10－6～10－8

无定向性获得降解能力的几率很小降解基因的传递：几率更小水处理中一般发生驯化的现象很多，所以很难用“突变”来解释。2）诱导酶的激活或抑制剂的解除抑制系的解除一般只需要2～5分。而驯化周期一般几天到几个月，很难全部用诱导酶解释第五节微生物的驯化与保藏45第四十五页，共七十一页，2022年，8月28日3）降解微生物的高浓度化∵基因突变不可能同时产生大量变异细胞∴微生物的高浓度化是重要的步骤质粒的传递速度供体浓度D（douor）（g/l）受体浓度R（recipient）（g/l）转移体浓度T（transconjugant）（g/l）接受质粒后的细胞（基因重组体）质粒的传递（基因重组）：接合等选择性繁殖高浓度化的途径第五节微生物的驯化与保藏46第四十六页，共七十一页，2022年，8月28日3.影响驯化的因素1）驯化操作方式活性污泥对苯酚的驯化的例子（中村，1990）驯化由快到慢的顺序：vi>iv,iii>i,v>ii间歇操作比连续操作有利。i.好氧、间歇、负荷上升法ii.好氧、连续、负荷上升法iii.厌氧/好氧、间歇、负荷上升法（0.10.7kg/m3d）0.7kg/m3div.好氧、间歇、高负荷一定v.好氧、连续、高负荷一定vi:厌氧/好氧、间歇、高负荷一定第五节微生物的驯化与保藏47第四十七页，共七十一页，2022年，8月28日2）接种微生物的种类活性污泥、土壤、接触污水的底泥、污水排放沟积泥3）水的硬度的影响硬水优于软水。∵软水中微量营养盐不足（VashonR.D，1982）Nitrilotriacetate(NTA)去除率达90%时所需时间，硬水18天，软水28天第五节微生物的驯化与保藏48第四十八页，共七十一页，2022年，8月28日4）原生动物的影响原生动物的存在将延长驯化周期。降解细菌被捕食，例如：城市污水中PNP的降解。PNP（p-nitrophenol）<WigginnsB.A.1988>被浓度（μg/L）2－PNP100（2，4－D）周期（无原生动物）09周期（有原生动物）610第五节微生物的驯化与保藏49第四十九页，共七十一页，2022年，8月28日

性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素：

a）变异；b）污染；c）死亡微生物的保藏与复壮50第五十页，共七十一页，2022年，8月28日菌种的衰退和复壮遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的。在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。51第五十一页，共七十一页，2022年，8月28日一、菌种的衰退

菌种衰退（degeneration）：指由于自发突变的结果，使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。

纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种52第五十二页，共七十一页，2022年，8月28日（一）菌种衰退的表现

菌落和细胞形态改变：生长速度缓慢，产孢子越来越少;

代谢产物生产能力下降，即出现负突变；致病菌对宿主侵染能力下降；对外界不良条件的抵抗能力下降等。53第五十三页，共七十一页，2022年，8月28日（二）菌种衰退的原因

基因突变－－主要原因

1、有关基因发生负突变导致菌种衰退；

2、表型延迟造成菌种衰退；

3、质粒脱落导致菌种衰退。连续传代－－加速衰退不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退54第五十四页，共七十一页，2022年，8月28日（三）菌种衰退的防止

控制传代次数创造良好的培养条件利用不易衰退的细胞移种传代采用有效的菌种保藏方法讲究菌种选育技术定期进行分离纯化55第五十五页，共七十一页，2022年，8月28日二、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。56第五十六页，共七十一页，2022年，8月28日菌种复壮的主要方法1、纯种分离法

菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。平板表面涂布法平板划线分离法琼脂培养基浇注法用分离小室进行单细胞分离用显微操作器进行单细胞分离菌丝尖端切割进行单细胞分离57第五十七页，共七十一页，2022年，8月28日2、宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。

3、淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。4、遗传育种法把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。58第五十八页，共七十一页，2022年，8月28日菌种的保藏

菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的

菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。59第五十九页，共七十一页，2022年，8月28日二、菌种保藏的原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株60第六十页，共七十一页，2022年，8月28日三、菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。61第六十一页，共七十一页，2022年，8月28日

斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法62第六十二页，共七十一页，2022年，8月28日（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏;此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。63第六十三页，共七十一页，2022年，8月28日（二）石蜡油封藏法

是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。64第六十四页，共七十一页，2022年，8月28日（三）砂土管保藏法一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。

砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约1～10年。

该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。65第六十五页，共七十一页，2022年，8月28日（四）麸皮保藏法

又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，