第三讲转录后的加工

第三讲转录后的加工第一页，共七十九页，2022年，8月28日主要内容：一、和RNA加工修饰有关的概念：二、真核生物RNA修饰加工的过程：三、原核生物与真核生物mRNA的特征比较：四、RNA合成与DNA合成异同点：第二页，共七十九页，2022年，8月28日一、和RNA加工修饰有关的概念：真核生物中都存在割裂基因(Interruptedgenes)：即基因是由内含子和外显子相间排列的。在低等真核生物的基因中割裂基因仅占很小的一部分，但是在高等真核生物基因组中绝大部分都是割裂基因。内含子的数目和长度不同使基因间长度差别很大。在一个典型的哺乳动物基因中约有7~8个外显子，分布在16kb

左右的范围内。外显子较短(100~200bp)，内含子较长(1kb)。第三页，共七十九页，2022年，8月28日剪接(RNAsplicing)：内含子的去除和外显子的连接过程就称为剪接或称为RNA剪接。不均一核RNA(heterogeneousnuclear,hnRNA)：mRNA

的初始转录产物比成熟的mRNA平均长度长，非常不稳定，序列的复杂程度也非常高，称为不均一核RNA。第四页，共七十九页，2022年，8月28日二、真核生物RNA修饰加工的主要方式：pre-RNAcappingtailingsplicingmethylationediting生物学意义;matureRNA

●preventpre-RNAfromdigestedbyRNase(interruptedRNA)astemplate(proteintranslation)l

interruptedgenemoveintrons(stopcodon)第五页，共七十九页，2022年，8月28日（一）、pre-RNAcapping

Cap-0m7GpppXpYp-------(共有)Cap-1m7GpppXmpYp-------Cap-2m7GpppXmpYmp-------

帽子定义：mRNA5’端的第一个核苷酸总是7-甲基鸟苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5’端的这种结构称为帽子（cap）第六页，共七十九页，2022年，8月28日m7Gppp鸟甘酸转移酶第七页，共七十九页，2022年，8月28日●After30±Nttranscripted,pre-RNAcappingstart

5’pppXpY---------------------(30Nt)-3’(pre--RNA)

pippXpY-----

mRNAcappingproceedingGTPRNAguanylyltransferaseRNAG-7-methyltransferaseppippXpYp-----------Gpm7GpppXpYp-----------------(withCap-0)Nt-phosphohydrolaseSAMSAH第八页，共七十九页，2022年，8月28日SAMm7GpppXmpYp---------------m7GpppXmpYmp---------------SAM;S-Adenosyl-L–methionine（腺苷甲硫氨酸）SAH;S-Adenosyl-L–homocysteine（腺苷高半胱氨酸）2’-O-methyltransferase2’-O-methyltransferaseGpppXpYp----------------m7SAH(withCap-1)SAMSAH(withCap-2)第九页，共七十九页，2022年，8月28日在有些真核生物中，当前二位是腺嘌呤，且2‘羟基被甲基化后，其第二位氨基酸的第六位的氨基也可以被甲基化；第十页，共七十九页，2022年，8月28日

帽子结构功能：①能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合，提高翻译效率；②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5’末端，以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。第十一页，共七十九页，2022年，8月28日（二）、pre-RNAtailing1、识别信号：在poly(A)添加位点的上游11-30个核苷酸区域内存在一段AAUAAA

序列。是poly(A)添加信号。Rabbitα-globinmRNA5’-------CUUUGAAUAAA-----------poly(A)3’-20Rabbitβ-globinmRNA5’-------UGGCUAAUAAA-----------poly(A)3’-20Manα-globinmRNA5’-------CUUUGAAUAAA------------poly(A)3’-20Manβ-globinmRNA5’-------UGCCUAAUAAA------------poly(A)3’-20第十二页，共七十九页，2022年，8月28日2、mRNA3’端的加尾时间：转录过程中暴露出AAUAAA信号后，核酸酶在该信号下游约11－30个碱基处进行切割。polyA的长度一般是50－200个碱基左右。第十三页，共七十九页，2022年，8月28日3、添加过程：

CPSF(cleavageandpoly(A)specificfactor)：识别AAUAAA序列并指导其他因子活性的发生。CSF(cleavagestimulationfactor)：结合到切割识别位点下游的富含G-U

的序列上，并且导致CPSF与AAUAAA强烈结合。PAP(poly(A)polymerase)：在ployA添加位点添加A；内切酶：(由CFI和CFII构成)，功能是对RNA进行切割。核酸内切酶5’m7G---------------------AAUAAA------------GUGUGU-------3’PAPCSFCSFCPSF切割复合体：第十四页，共七十九页，2022年，8月28日

PABP(poly(A)BindingProtein)：Promotionpoly(A)elongation

只有RABP结合到寡聚A上，PAP才能将PolyA尾巴延伸到200个碱基的长度。第十五页，共七十九页，2022年，8月28日切割复合体的组装内切酶进行切割polyA聚合酶合成短的多聚A在PABP结合到短的多聚A后，聚合酶继续添加A第十六页，共七十九页，2022年，8月28日4、mRNApoly(A)尾功能：A、防止mRNA降解，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。B、是mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。C、与翻译有关：切除poly(A)尾会影响翻译起始。第十七页，共七十九页，2022年，8月28日（三）、RNAinternalmethylation

m5C

m6A

HNHHNHOO

HNH

HN—CH3H3C第十八页，共七十九页，2022年，8月28日常见tRNA中的修饰核苷酸Cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U（5-甲氧基羰甲基尿苷）Xm5s2U（5-甲基-2硫代尿苷）K2C（2-赖氨酸胞苷）Com5U（5(2)-羟羧甲基尿苷）I（Inosine次黄嘌呤）m7G(7-甲基鸟苷)m5C（5-甲基胞苷）m6A（6-甲基腺苷）s2C（2-硫代胞苷）ψ(假尿苷）Um(2’-O-甲基尿苷)Xo5U(5-羟基尿苷)第十九页，共七十九页，2022年，8月28日（四）、RNA的剪接第二十页，共七十九页，2022年，8月28日（1）、底物：核内RNA(nRNA/hnRNA)l

RNApolI→18s,5.8s,28srRNA(nucleolus：核仁)RNApolII→mRNA(nucleoplasm)RNApolIII→tRNA,5srRNA,U6-SnRNA(nucleolus&nucleoplasm)

l

pre-mRNAX≈7kb±;Max.≈20kb;4-10xmatureRNAX≈8Introns

1、剪接的分子基础：第二十一页，共七十九页，2022年，8月28日（2）核小RNA（SnRNA）

SnRNA≤250Nt;RichU(namedSnRNAU1—U6)l

(Pre-RNA+nucloe-protein)→250kdcomplex

完成splicing剪接体(3)、剪接体－核糖核蛋白体：第二十二页，共七十九页，2022年，8月28日（4）、

Intron---外显子-内含子交界区域

高度保守，成为剪接过程重要的识别序列

人类许多重要疾病的病因junctionseq.mut.→异常剪接→病症例；地中海贫血症Junctionseq.mut.ofGlobingene→干扰mRNA成熟

第二十三页，共七十九页，2022年，8月28日---IntronsbeclassifiedintoI,II,IIIby外显子-内含子交界区域

具有IntronIorIIorIII的基因分布不同(nuclear,mt,ct)IntronI,II,III的保守序列不同，剪接机制不同

三类内含子的区别：groupIofintron(nuclear&mitochondrial)groupIIofintron(mitochondrial)groupIIIofintron(nuclear&chloroplast)

第二十四页，共七十九页，2022年，8月28日2、RNAsplicingmodels

1）、splicingmodelsofgroupIofintron(nuclear&mitochondrial)A、四膜虫35SrRNA的结构：四膜虫的三种rRNA转录物在一条35S的产物中，经加工可以生成5.8S、17S和26SrRNA。大的(26S)rRNA位于3¢端。在有些四膜虫种类中，26SrRNA基因只有一个很短的内含子。GroupIofintron首先是在四膜虫35SrRNA前体研究中发现的：（1）、I类内含子的结构特点：26s414Ntintron第二十五页，共七十九页，2022年，8月28日B、Junctionsequence特征：高度保守，转酯反应的攻击位点

●5’---exon----U------intron------G----exon-----3’

donorreceptorC、I类内含子内部形成的二级结构：

所有的I类内含子均含有9个发卡结构的(P1-P9)特征性二级结构。突变分析证明P3、P4、P6和P7属于核心结构；

其中P4和P7是最为保守的序列。第二十六页，共七十九页，2022年，8月28日P1包括左侧外显子的3¢端，内含子内与此外显子配对的序列称为内部向导序列(Internalguidesequence，IGS）

P7和P9之间有一段非常短的序列，可与内含子3¢端的G前面的碱基序列配对。第二十七页，共七十九页，2022年，8月28日

突变分析证明，碱基配对对于I类内含子产生核心结构，形成核酶的活性中心，进行自我剪接极其重要。

I类内含子二级结构的作用：例如：当把突变体引入内含子共有序列中，该突变会影响碱基配对，进而阻止剪接的进行。但通过恢复碱基配对的补偿性突变可以使突变体恢复正常，能够进行自我剪接。第二十八页，共七十九页，2022年，8月28日I类内含子通过转酯反应进行自我剪接2）、I类内含子的自我剪接过程：414Ntintron需要一价阳离子、二价阳离子；游离的鸟苷酸：GTP、GDP、GMP均可；反应不需要外部能量的供给。B、剪接发生的条件：linearrDNAof35srRNAseq.

35srDNAA、四膜虫35SrRNA的结构：26s第二十九页，共七十九页，2022年，8月28日第二次转酯反应由新产生的外显子3’-OH攻击下游邻近内含子3’端“G—O--P--N”，并与外显子相连，同时释放线状内含子。内含子的自我剪接包括三次转酯反应：第一次转酯反应由游离的G

（GTP、GDP、GMP均可）发动，G的3¢-OH

攻击外显子的3¢末端“U--O--P—N”，并与之相连，产生G-内含子和外显子的3¢-OH末端。C、I类内含子的剪接过程：游离的线状内含子发生第三次转酯反应而形成环状。第三十页，共七十九页，2022年，8月28日自拼接的转酯反应中化学键之间交换直接进行。第三十一页，共七十九页，2022年，8月28日I类内含子的剪接是自我催化的结果I类内含子之所以有催化活性是因为它能产生一种特殊的二级结构或三级结构，而这些结构形式能产生与传统的蛋白质酶一样的活性中心：鸟嘌呤结合位点和底物结合位点。第三十二页，共七十九页，2022年，8月28日第一次转酯反应：G占据G结合位点，外显子的3‘末端占据酶的底物结合位点。G的自由羟基攻击内含子的5‘端。第三十三页，共七十九页，2022年，8月28日第二次转酯反应：内含子的第414位点上的G占据G结合位点，外显子的3‘端占据酶的底物结合位点。外显子的3’碱基的自由羟基攻击内含子3‘末端G的3’羟基，发生转酯反应，将两个外显子连接起来，同时生成内含子。第三十四页，共七十九页，2022年，8月28日第三次转酯反应：生成的内含子3‘端414位上的G占据酶的G结合位点，内含子的5’端占据底物结合位点，发生第三次转酯反应：414位的G攻击内含子近5‘端的碱基（A16或U20）的5‘磷酸基团，发生转酯反应，内含子环化，同时生成一段短的G－核酸。第三十五页，共七十九页，2022年，8月28日

环状分子G414-A16（G414-U20)在体外可被水解，变成线状，这一过程叫做逆环化(Reversecyclization)。G414-A16产生的线状分子再次发生环化（G414攻击U20）。因此，最终都形成G414-U20环状分子。第三十六页，共七十九页，2022年，8月28日被剪除的内含子可利用其3‘端的位点与5’的相应位点发生反应而环化第三十七页，共七十九页，2022年，8月28日

G414-U20在体外发生逆环化，水解开环（在G414-U20之间解开）而产生一种线性分子，称为L-19RNA。L-19分子具有酶活性，能催化短的寡核苷酸的延伸，因此将该种类型的酶称为核酶。第三十八页，共七十九页，2022年，8月28日L19aspolymeraseofpoly(C)3‘-G-OHGGGAGGpCCCCC-OHGGGAGGpCCCCC-OH3‘-G-OH3‘-GC-OHGGGAGGpCCCCCC-OH3‘-GGGGAGGC-OH3‘G-OHGGGAGGHO-CCCCpHO-CCCCCCp第三十九页，共七十九页，2022年，8月28日总结：

2、

Intron的剪接经过4次转酯反应

1、2th414Nt3ed16+399Nt4rd4+395Nt(L19)

1、

GMP（GDP,GTP)通过转酯（trans-esterification）方式进入Intron第四十页，共七十九页，2022年，8月28日3、

剪接过程不需其他的任何酶类与能量这是因为：剪接活性由35sRNA自身催化（auto-catalysis)完成；一处的磷酸酯键转化为另一处新的磷酸酯键（转酯反应），反应不需以分解高能前体物（NTP）为代价，形成新的磷酸酯键。其破坏的磷酸酯键与形成的磷酸酯键总是相等。第四十一页，共七十九页，2022年，8月28日L19发现的生物学意义:1、发展了具有催化功能的大分子种类

Pepzyme（肽酶）ChemzymeRibozyme(3~400Nt)

Enzyme第四十二页，共七十九页，2022年，8月28日UAA

Pepzyme侧链基团的多样性分子构型的稳定性→进化中取代Ribozyme

2、分子进化理论的发展

RNA是原始生命中最早具有催化功能（切割，连接）的酶活性物质？！

B、RNA是原始生命中最早具有遗传信息载体功能的物质，可自我复制。但DNA分子结构的稳定以及双链分子在复制，转录中的优势→进化中取代RNA的遗传信息载体功能。

A、酶活：第四十三页，共七十九页，2022年，8月28日3）、GroupIIsplicingmodelA、Junctionsequence

B.S：BranchSiteof7Ntupstreamof3’-junctionseq.

●5’----exon-----GUGCG---------B.S----PyAU----exon---3’

供点受点----PyPuPyPyUAPy---(Py嘧啶；Pu嘌呤）100%

第四十四页，共七十九页，2022年，8月28日●在BranchSite的两侧存在一些短的序列，这些区域可以与该内含子上游特定序列之间发生互补，形成茎环结构(但B.S中的A不包含在互补序列内,从而被排除成芽状突起）

5’--GUGCG--------------------PyPuPyPyUAPy-----PyAU—3’Intron

IRIR

5’GAU3’

AB、内含子的结构：第四十五页，共七十九页，2022年，8月28日C、Splicingmechanism（两次转酯反应）：

Intron

IRIR

A5’GAU3’

Exon1Exon2GAintron

PyAU

两个外显子连接在一起转酯攻击位点intron

OHAU

2‘A3‘G游离的内含子形成套索结构B.S中的A上的2¢-OH发动第一次转酯反应5‘3‘外显子的3‘末端OH攻击内含子3’末端的U，发生第二次转酯反应。第四十六页，共七十九页，2022年，8月28日5’---E1---AAUAGGUGA--------I1-----UACAGGUUG---E2-----E2--CUCAGGUACA-------I2-------UCAGGUUG---E3-----E3-------CCAGUAA---------I3-----UACAGGAA------E4-----E4-------AUGGUAA--------14-------AAAGGU--------E5-----E5-------GAGGUAUAU----I5-------CCAGCAA------E6-----E6-----GCAGGUAUGG---I6-------GCAGCUU-----E7---3’●Intron与Exon的连接处存在部分同源的consensusseq.卵清蛋白（Ovalbumin）mRNA(6Intron,7Exon)4）、GroupIIIsplicingmodel第四十七页，共七十九页，2022年，8月28日A、Junctionsequence●5’---exon---GU--------intron--------AG------exon----3’供点100%94%受点●7Ntbranchsiteinupstreamof3’junctionseq.pyNpyUpuApyB.S序列：B.S第四十八页，共七十九页，2022年，8月28日B、III型内含子的剪接机理－－由剪接体实现

剪接的分子基础：剪接体由蛋白质和小RNA组成。在自然状态下，它们以核糖核蛋白颗粒(snRNP)的形式存在。细胞核中的小分子RNA称为核小RNA(SmallnuclearRNAs，snRNA）。snRNA参与剪接过程，并与其它蛋白质一起构成一个大的颗粒复合体，称为剪接体(Splicesome)。；位于胞质中的称为胞质小RNA(CytoplasmicRNA，scRNA):细胞质小RNA参与蛋白质的合成和运输。在核仁中也存在着一类小的RNA，称为snoRNAs，它们在rRNA的加工中起作用。第四十九页，共七十九页，2022年，8月28日参与剪接反应的snRNPs包括U1，U2，U4，U5和U6。人的U1snRNA含有8种蛋白质，U1snRNA折叠成独特的二级结构。其U1snRNA其5¢末端的11个核苷酸呈单链状态，含有一个可与内含子5¢剪接点保守序列互补的一段序列。互补对于内含子的正确剪接很重要。第五十页，共七十九页，2022年，8月28日C、III型内含子剪接的过程：第一步是由B.S序列中保守A的2‘－OH对外显子3¢剪接点的发动亲核攻击。

两次转酯反应：第二步是由第一步中释放的外显子的自由3‘-OH攻击内含子3‘剪接点。内含子形成套索结构。第五十一页，共七十九页，2022年，8月28日BranchSiteALariatofintron第五十二页，共七十九页，2022年，8月28日5）、剪接的调控（groupIII）

●对受点序列的选择CAG=UAG>AAG>GAG

●剪接类型；

组成型剪接（constitutivesplicing）

cuttingeachintroninonebyone

选择性剪接

(alternativesplicing)createisoformprotein>5%geneinmammal

个体发育，细胞分化

●对供点或受点的选择剪接的准确与否

选择性剪接：一个初始转录本按多种方式进行剪接，有些外显子在成熟mRNA中可以出现或缺失，从而一种基因的转录本可以产生多种成熟的mRNA。第五十三页，共七十九页，2022年，8月28日Alternativesplicing具有非常重要的生物学意义。选择性剪接研究最清楚的是果蝇的性别决定系统。果蝇的性别决定涉及了一系列基因的相互作用，并且是可变剪接产生了雌雄果蝇。第五十四页，共七十九页，2022年，8月28日l

果蝇性别的发育与X性染色体和常染色体的比例相关

XX/AA=1发育成雌性果蝇

X/AA=0.5发育成雄性果蝇这种调控关系在胚胎发育早期就已确定，并保留记忆于体细胞中l

3个关键基因参与果蝇的性别决定

sxl(性致死基因)tra(转化基因)dsx(两性基因)

性别分化的分子基础：第五十五页，共七十九页，2022年，8月28日Sxl基因中的外显子3

中含有一个终止密码子，在雄蝇中的mRNA产物中含有外显子3，但雌蝇中无此外显子，因此只有雌蝇产生Sxl蛋白质。是X染色体与常染色体的比例决定了sxl基因的mRNA的剪接方式。Sxl基因的选择型剪接：12345678SxlSexlethal（8exon）stopcodonFemalealternativesplicingMalenormalsplicing1245678AAAA12456783AAAAActiveproteinInactiveprotein第五十六页，共七十九页，2022年，8月28日Tra基因含有4个外显子，其中外显子2含有一个终止密码子；Tra基因的剪接：在雌性果蝇中，Sxl蛋白是一种剪接因子，Sxl蛋白的存在阻止了Tra基因外显子2的正常剪接，从而忽略了一个完整的外显子2。产生有活性的TRA蛋白；而在雄性果蝇中，由于不存在Sxl蛋白质，Tra基因仍然按照正常的方式进行剪接。产生没有活性的TRA蛋白；第五十七页，共七十九页，2022年，8月28日1234TraTransformer(4exon)1234AAAA134AAAAStopcodonFemalealternativesplicingMalenormalsplicingActiveproteinInactiveprotein

所以tra基因仅在雌性果蝇中产生蛋白质，在雄性蛋白中没有活性蛋白产生。此蛋白也是一个剪接调节物。第五十八页，共七十九页，2022年，8月28日Dsx基因的初级转录本共有6个外显子；

雌性果蝇在Tra蛋白的作用下，1、2、3、4号外显子剪接成成熟的转录本；dsx基因的剪接：雄性果蝇由于没有Tra蛋白，1、2、3、5、6号外显子剪接成成熟的转录本；选择性剪接的结果是每种性别中都产生了不同的DSX蛋白：雄性产物阻止了雌性性别分化，而雌性产物抑制了雄性专一性基因的表达。第五十九页，共七十九页，2022年，8月28日dsxdoublesex(6exon)FemalealternativesplicingMalesplicing123456123AAAA56134AAAA2DSX-pFemaledevelopdsx-pMaledevelop第六十页，共七十九页，2022年，8月28日总结：果蝇中特定基因的选择性剪接决定了其性别分化两种染色体比例决定了雌性中Sxl基因的剪接弃掉外显子3，产生有活性蛋白Sxl蛋白的存在使Tra基因按照弃掉外显子2的剪接方式进行。产生有活性蛋白。Tra蛋白的存在使雌性果蝇的Dsx基因按照将前4个外显子连接在一起的剪接方式进行。Tra蛋白可以抑制雄性基因的表达，从而向雌性方向分化。第六十一页，共七十九页，2022年，8月28日发生选择性剪接的特定条件

l

DNAmutationordeletion→供体,受体位置和数目的改变●一条基因中有两个以上的转录起点或两个以上加尾信号

l

特化细胞内的alternativesplicing调控机制→isoformproteinl

RNP中SnRNA或protein异常→剪接方式的改变

第六十二页，共七十九页，2022年，8月28日6)、反式剪接（trans-splicing）

●以一条pre-RNA

为底物以两条不同来源的pre-RNA

为底物

●在spliceosome中完成在spliceosome中完成

●组成型剪接在成熟RNA的leadingsequence处或选择性剪接拼接一外来的35Nt的splicedlead(对供点或受点的识别差异)(SL,剪接引导序列)或mini-exon

cis-splicingtans-splicing

●lariatintronY-intron

第六十三页，共七十九页，2022年，8月28日A、反式剪接的发现与证实锥虫

可变表面糖蛋白（VGS）基因中发现（VandePloeg1982）

●锥虫中几乎所有mRNA的5’-end

均有相同的35Ntseq.(mini-exon)

●maturemRNA35Nt外来RNAVGS

5’第六十四页，共七十九页，2022年，8月28日●锥虫genome中发现包含有35Ntseq.在内的135Nt的重复序列（约200个拷贝）

●病毒线虫植物(mt,ct)

人体

5’---tgaactAANNCNNNNNNNNCAGTTTCTGTACTNNATTGgta--3’

P35Ntmini-exonconsensusintron

均有发现Highconservative第六十五页，共七十九页，2022年，8月28日●Splicing

Model：---GroupIIIpre-mRNA中AUG上游（leadseq.）30-70Nt

存在通用方式剪接的受点（3’AG）

pre-mRNA的AUG上游序列中的一个A2’-OH对SL序列内含子中供点的G发动攻击，发生转酯反应，与SL中供点的G以2’,5’磷酸酯键连接，并生成游离的前导序列。游离的前导序列3‘－OH攻击受点（3’AG）形成Y-intron和成熟的mRNA。第六十六页，共七十九页，2022年，8月28日

锥虫的反式剪接方式AAA第六十七页，共七十九页，2022年，8月28日7）、酵母tRNA的剪接与成熟在400个左右的酵母tRNA基因中，有40个割裂基因，均只含有一个内含子，位于反密码子环3¢端，长度在14-16bp

之间。A、酵母tRNA的结构特点：在所有的酵母tRNA内含子中，并没有发现可被剪接酶识别的保守序列。所有酵母tRNA的内含子中都含有一段与反密码子环互补的序列。第六十八页，共七十九页，2022年，8月28日酵母苯丙氨酰tRNA前体中的一个内含子可以与反密码环配对，从而改变了反密码臂的结构。此RNA前体内含子环与“茎”上一