细胞冻存复苏及腹水制备

细胞冻存复苏及腹水制备第一页，共四十页，2022年，8月28日购买抗原或提取抗原免疫小鼠检测效价解冻NS1制备饲养细胞融合检测抗体三次克隆化扩大培养冻存细胞接种小鼠腹腔7-10天前注射液体石蜡抽取腹水腹水纯化标记单抗鉴定立项复苏并培养项目组进行评价一腹水制备组的主要工作第二页，共四十页，2022年，8月28日我们主要制备的腹水有三类：1，研发性：即小样，要求注射两只小鼠，至少5ml腹水。2，中样：从小样里面筛选出来的细胞株，一般要求5只。3，生产性：供应生产用的腹水。腹水制备的原则：保质保量！对我们的要求：必须要有高度的责任心。第三页，共四十页，2022年，8月28日目前，大量生产单抗的方法主要有两种：1，体外培养法，从上清中获取单克隆抗体（1）悬浮培养法：和常规静置培养相比，增加了细胞生长空间，使单位体积内细胞数量增多，从而增加抗体量。（2）固相培养法：单层培养和悬浮培养的结合，主要用于贴壁性较强的杂交瘤细胞，以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，细胞固定在载体表面生长。体外培养法优点：工艺简单，易于控制，目前上市的单抗多用此法。体外培养法缺点：抗体浓度低，一般含量为200～500μg左右。二，为什么要制备腹水？第四页，共四十页，2022年，8月28日2.动物体内诱导法（1）实体瘤法：将对数期细胞按(1～3)×107个/ml接种于小鼠背部皮下，多点注射，待肿瘤达到一定大小后可采血获得抗体，一般1～10mg/ml，缺点是采血量有限。（2）腹水制备法：腹水抗体的浓度达2～5mg/ml，一般可以抽取5ml左右腹水。该法优点：操作简单、经济，是一般用途单克隆抗体制备的首选方法，一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。第五页，共四十页，2022年，8月28日三，腹水产生的原因：1，杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，大量肿瘤细胞在腹腔中生长，分泌很多刺激性的因子，胶体渗透压升高，导致腹水产生。2，杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激，引起炎症反应导致腹膜上的毛细血管通透性增加，体液漏出，形成腹水

。第六页，共四十页，2022年，8月28日四，液体石蜡的作用：1，免疫抑制剂，注射石蜡油（降植烷和不完全福氏佐剂）可以降低小鼠的免疫力，从而降低小鼠对接种的杂交瘤细胞的排斥反应；2，石蜡（降植烷、不完全福氏佐剂）可以强烈刺激小鼠产生白细胞介素6（IL－6），IL－6是最重要、最主要的浆细胞（成熟的抗体分泌细胞）生长因子，因此注射上述几种物质都可以通过刺激IL－6的产生，为接种的杂交瘤细胞提供较好的生存环境并促进腹水的形成。

第七页，共四十页，2022年，8月28日注射液体石蜡注意事项：1，拿小鼠姿势正确，不要被咬伤。2，不要将针头对着其他人。3，石蜡不能注射到皮下。4，注射石蜡时要注意石蜡的量（0.5ml）。5，发现不同性别小鼠时要将其分开。6，注射完毕后要及时做好标记。7，发现缺水少食时应及时提醒添加。第八页，共四十页，2022年，8月28日第二章，细胞的复苏一，确定复苏的细胞数二，制备适量的饲养细胞三，细胞的复苏四，细胞复苏的注意事项第九页，共四十页，2022年，8月28日一，首先确定复苏的细胞数1，比较紧急的项目对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急，紧急的项目要随时准备复苏。例如，目前紧急的有肿瘤系列细胞如CA153CR，CA724，colo205等。中样腹水一般由领导直接下单子。2，根据实际情况自行安排一般按项目进行复苏，先紧同一个项目复苏，切忌不要同时复苏多个项目，这样容易弄乱，并且交接时比较麻烦。第十页，共四十页，2022年，8月28日二，制备适量的饲养细胞

确定完复苏的细胞数量后就要准备饲养细胞，一般一只小鼠的饲养细胞可以配置100mlDMEM培养基，根据细胞数量的多少确定小鼠的数量，加样备用。目前，一般情况24孔板1.5ml/孔，6孔板5ml/孔，大平皿30ml/板。注意事项：1，培养液和血清必须用新的，并记录批号。2，制备过程严格无菌操作。3，第二天确定没有污染后方可使用。第十一页，共四十页，2022年，8月28日三，细胞的复苏1、将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后以75%酒精消毒，移入无菌操作台内。2、取50ml离心管，加入细胞冻存前所用基础培养液5ml。3、根据复苏申请单，由细胞管理员将细胞从液氮中取出，细胞使用人核对后，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以75%酒精消毒?，移入无菌操作台内。4、取出复苏细胞悬浮液，缓缓加入已准备的培养液中，混合均匀后，1500rpm离心5min。5、将离心管取出，弃去上清，用含血清培养基重悬后,加入6孔板或小号平皿中，观察细胞复苏时状况并记录，37℃5%CO2培养。6、次日观察有无污染。第十二页，共四十页，2022年，8月28日以下原因可能导致复苏失败：1，饲养细胞有污染却没有发现。2，细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。3，操作过程存在污染。4，没有更换枪头，导致交叉污染。5，没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。第十三页，共四十页，2022年，8月28日四，细胞复苏的注意事项：1，所用器材经过高压处理，培养基和血清是新的。2，整个过程保证无菌操作。3，复苏的关键是速融，一般在1min内。4，及时更换枪头，避免交叉污染。5，及时记录细胞的名称及其编号批号，切忌弄混。6，复苏完毕后重新核实复苏的细胞名称和编号批号。7，填写复苏记录表。第十四页，共四十页，2022年，8月28日细胞复苏时机的选择：平时一般选取在周五，原因：一般情况周五复苏后下周一会有一半细胞可以注射小鼠，一般三四天可以全部注射完，7天后的周一开始抽取，这样周末就不会太忙。假期前要合理规划复苏时间，不要留太多，一个制备周期大概就是20天左右。第十五页，共四十页，2022年，8月28日第三章，细胞的培养和消化一，细胞培养的概念及生长方式二，细胞的常见污染及处理三，细胞的消化四，细胞培养的注意事项第十六页，共四十页，2022年，8月28日一，细胞培养的概念：把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养的培养物可以是单个细胞（称为克隆培养），也可以是细胞群（称为群体培养）。见下图：第十七页，共四十页，2022年，8月28日2023/2/19概述群体培养克隆培养第十八页，共四十页，2022年，8月28日细胞的生长方式：（1）贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。（2）悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。第十九页，共四十页，2022年，8月28日一次培养细胞的生长周期第二十页，共四十页，2022年，8月28日2023/2/19二，细胞培养的污染细菌污染小鼠胃癌细胞的球菌感染

培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，PH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。第二十一页，共四十页，2022年，8月28日2023/2/19二，细胞培养的污染真菌污染

培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。丝状菌污染的污染第二十二页，共四十页，2022年，8月28日二，细胞培养的污染支原体污染培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。支原体污染检测阳性阴性第二十三页，共四十页，2022年，8月28日2023/2/19二，细胞培养的污染病毒污染尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。冠状病毒扫描电镜图第二十四页，共四十页，2022年，8月28日2023/2/19二，细胞污染的处理原则细胞培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之，并且用NaOH处理；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。小鼠腹腔回收法：小鼠腹腔是一个天然的过滤系统，将被污染的杂交瘤细胞注射进去后，腹腔会将污染物自动清除（包括支原体），等到长出腹水无菌操作回收细胞即可。

第二十五页，共四十页，2022年，8月28日三，贴壁细胞的消化：1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。

4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。

5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来，1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

第二十六页，共四十页，2022年，8月28日三，贴壁细胞的消化：1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。

4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。

5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来，1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

第二十七页，共四十页，2022年，8月28日四，细胞培养时的注意事项：1，要定期观察细胞的状态，发现问题及时处理，切忌将细胞弃之不顾。2，不能频繁将细胞拿进拿出，会影响细胞的生长。3，不能频繁更换培养基，细胞生长有一个适应过程。4，必须更换培养基时应严格无菌操作，避免交叉污染。如液体变黄，死细胞过多等原因可考虑换液。5，培养基应该做到专人专用。6，发现细胞污染后需要及时处理，避免传染。第二十八页，共四十页，2022年，8月28日第四章，腹水的制备一，细胞的准备二，小鼠的选择三，细胞的注射四，腹水的抽取第二十九页，共四十页，2022年，8月28日一，细胞的准备：细胞复苏后要密切关注其生长状态，一般要求注射数量为（5-10）×105个/只，研发性细胞要求超过3/4孔注射两只。注射的细胞要求状态良好，处于对数期，细胞又圆又亮。经验：一般情况下一批细胞复苏后两天就可以注射总数的一半，三天后注射剩下的一半，7天内基本可以全部注射。如果发现细胞聚堆现象要轻轻吹开，状态不好的细胞要换液并且加饲养细胞，但操作要轻柔。第三十页，共四十页，2022年，8月28日吹打细胞时注意事项：1，动作轻柔，不能溅到其他孔中2，细胞时被吹掉的而不是被划掉的，不能留死角3，及时更换枪头，避免交叉污染4，及时在离心管上写上细胞信息。生理盐水洗细胞时注意事项：1，盖子要对号入座，避免交叉污染。2，加生理盐水时应悬空，不能回溅到枪头上污染整瓶生理盐水第三十一页，共四十页，2022年，8月28日二，小鼠的选择小鼠的选择很研发重要，不仅关系到腹水的数量还关系到质量，研发性和中样细胞必须挑选状态好的小鼠，小鼠健康标准：1,食欲旺盛；2,眼睛有神，反应敏捷；3,体毛光滑，肌肉丰满，活动有力；4,身无伤痕，尾不弯曲，天然孔腔无分泌物，无畸形；5,粪便黑色呈麦粒状；6,小鼠的尾、趾有无溃烂；7,检查眼、耳、鼻、肛门有无分泌物和异常增殖物;8,肚子不瘪进去第三十二页，共四十页，2022年，8月28日三，细胞的注射

一般情况研发性细胞每只注射0.4ml，中样和大样注射0.2ml。注射完毕后要及时把项目名称和编号及注射时间记录到笼子上面。注意事项：1，细胞数量和状态2，细胞不能注射到皮下3，笼子上细胞信息要完整4，填写注射记录第三十三页，共四十页，2022年，8月28日四，腹水的抽取注射完细胞一周左右时间会长腹水，一般第六天就需要观察，防止胀死。小鼠腹腔明显胀大或者发黑就必须抽取，但首次抽取应该轻柔，不能抽取过度。个人操作对腹水产量有影响，因此尽可能熟练掌握，抽的又快又多。第三十四页，共四十页，2022年，8月28日抽取腹水时的注意事项:1，抽取时机的把握，一周左右肚子明显胀大或者发黑。2，抽取时应该轻柔，特别是第一次。3，抽取部位不能太靠近大腿，否则伤口难以愈合。4，研发性抽取时不要弄乱注射器，避免交叉污染，及时记录。5，每次抽取前后吹打干净针头，防止堵塞。6，发现针头变钝要及时更换。7，倒腹水时看清楚，不能倒乱，不能倒进去沉淀。8，抽取大样最好更换手套。第三十五页，共四十页，2022年，8月28日第五章，细胞的冻存一，冻存原因二，冻存要求三，冻存失败原因四，冻存时注意事项

第三十六页，共四十页，2022