细菌的转化与平板筛选

实验概要本实验介绍了细菌的转化与平板筛选的原理及操作步骤。实验原理感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0°C,CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用a互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌卩半乳糖苷酶的启动子及其编码a肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因。lacZ'基因编码的a肽链是卩半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。任何携带着lacZ基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种卩半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基P-D-硫代半乳糖苷）诱导后，在含有Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷）的培养基平板上形成蓝色菌落（半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝）。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位点后，就会破坏a肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的卩半乳糖苷酶相互补的活性a肽，而导致不能形成有功能活性的卩半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而显蓝色，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。主要试剂O.1mol/LCaCl2溶液LB液体培养基及LB固体培养基氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20C冰箱保存。Xgal:将Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20CoIPTG：取2gIPTG溶于8mL双蒸水中，再用双蒸水补至10mL，用0.22um滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20C。主要设备1.超净工作台2.低温离心机3.恒温摇床4.恒温箱5.恒温水浴离心管r-f>—tX试管培养皿锥形瓶接种针玻璃涂棒酒精灯13.镊子及牙签实验材料大肠杆菌DH5a质粒实验步骤1.制备感受态细胞1）吸取15plE.coil菌液,接种于20mlLB液体培养基中,37°C振荡培养过夜，待OD6oo=0.5左右将该菌悬液以1：50接种量转于50mlLB液体培养基中，37C振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20-30min测一次OD600,至OD600=0.6左右,停止培养。2）培养液转入离心管中，在冰浴10min,4°C下5000rpm离心10min。3）弃上清液，用4ml冰预冷的0.1MCaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30min。4）4°C下5000rpm离心6min。5）弃上清液，用2ml冰预冷的0.1MCaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。6）以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，分装于1.5ml离心管中，每管100pl感受态细胞悬液，置-70C条件下保存。.2.质粒DNA转化大肠杆菌1）取100pl摇匀后的感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入5pl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42IPTG水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min。2）加入900plLB液体培养基，则总体积约lml,混匀于37°C振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Ampr。3）在预制的LB琼脂平板上，力口40uL20mg/mL的Xgal和4uL200mg/mL的IPTG溶液，并用灭菌玻璃推子（酒精灯上烧后冷却），均匀涂布于琼脂凝胶表面，37C倒置吸收。4）将恢复培养的菌体4000rpm离心5min,移去上层900plLB培养基，用余下的lOOpl重悬菌体至均匀。a互补现象的检查将重悬菌体均匀涂布于含X-gal加IPTG加氨苄青霉素的LB平板上，37C倒置培养12-24h，出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。如果进一步验证，可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37C振荡培养6-8h，然后提取质粒酶切验证，或进行菌落PCR扩增鉴定。注意事项细菌生长状态和密度：不要用经过多次转接