分析不同pH下重组蛋白R1R2和R1R2CT二级结构特性,生物化学论文

分析不同pH下重组蛋白R1R2和R1R2CT二级结构特性,生物化学论文蜘蛛丝拥有优异的机械和生物学性能，是一种理想的多功能材料。由于蜘蛛自相捕食和产丝量小等，通过驯养蜘蛛获取大量蛛丝纤维的难度较高，因而采用生物技术的方式方法重组表示出蜘蛛丝蛋白成为获取仿生蜘蛛丝纤维的主要途径。到当前为止，在蛛丝仿生领域仍未获得突破，仿生的拟蛛丝纤维性能远不及天然蛛丝。研究表示清楚蛛丝蛋白的高分子量特性和成丝形式是决定丝纤维性能的重要因素，现已成为研究的热门。典型的蛛丝蛋白由氨基端(Nterminal，NT)、羧基端(Cterminal，CT)以及占到90%的重复区(Re－peat，R)构成。NT和CT高度保守，在蛛丝蛋白的分泌、储存和成丝等经过中起重要的调节作用。随着pH的降低(中性到酸性)，NT二聚化，构成蛋白网络；CT则能促进蛛丝蛋白的排列和可溶性的提高等，详细功能尚不清楚；R主要与蜘蛛丝性能相关。另外，蛛丝蛋白纤维化还遭到盐离子的影响，如氯化钠能够维持主壶腹腺丝蛋白(majorampullatespidroin，MaSp)NT单体的稳定性等。由于主壶腹腺体容易分离，分泌的主壶腹腺丝性能突出等优点，长期以来一直遭到青睐。2020年本课题组获得首条次壶腹腺丝蛋白(Minorampullatespidroin，MiSp)全长编码序列，经比对分析得知MiSp和MaSp的CT同源性较高，但MaSpCT含有两个保守半胱氨酸(Cysteins)，通过二硫键互相作用，构成平行二聚体；MiSpCT则没有Cys，二聚化机制和生物学功能尚未得到充分证实。为了进一步研究蜘蛛丝蛋白MiSp重复区R和羧基端CT的二级构造和功能，本实验通过克隆并在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中分别表示出R1R2CT和R1R2两个组合模块蛋白，借助Ni-NTA亲和色谱纯化，利用圆二色谱(circulardichroism，CD)测定并分析了不同pH条件下的重组蛋白R1R2和R1R2CT二级构造特性；采用扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM)表征R1R2和R1R2CT重组蛋白在不同pH及离子条件下的聚集和成丝情况，为成丝机理的研究奠定基础。1材料与方式方法1.1材料质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；EcoRⅠ、HindⅢ、BsaⅠ限制性内切酶和phusionHigh-FidelityPCRMMbuffer购自NEB公司(美国)；T4DNA连接酶购自Fermentas公司(美国)；6his抗体购自天根公司；Ni-NTA树脂购自Qiagen公司(德国)。1.2方式方法1.2.1克隆构建以MiSp全长基由于模板(GenBank登录号:JX513956)，以R1p1和R1p2为引物PCR扩增R1，以R2p1和R2p2为引物PCR扩增R2。BsaⅠ酶切R1和R2，酶切片段回收后由T4连接酶体外连接R1和R2；以连接产物为模板，以R1p1和R2p2为引物扩增R1R2；R1R2由EcoRⅠ和HindⅢ酶切，胶回收后的酶切片段与拥有一样酶切位点的载体连接。以R1R2为模板，以R1R2p1和R1R2p2为引物扩增片段R1R2，以CTp1和CTp2为引物扩增CT；R1R2和CT分别由BsaⅠ酶切，酶切片段回收后体外连接，连接产物用作模板，以R1R2p1和CTp2为引物扩增R1R2CT，产物经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后与载体连接，引物序列见表1，详细克隆构建经过如此图1。1.2.2融合蛋白的表示出将测序正确的重组质粒转化于Rosetta2(DE3)感受态细胞。挑取单克隆接种于5mLLB培养基(含卡那霉素30mg/L)。200r/min，37℃过夜培养。将5mL过夜培养物接种于500mL新鲜LB培养基(含卡那霉素30mg/L)，37℃震荡培养至OD600为0.9左右，温度降至25℃时参加终浓度为0.3mmol/L的IPTG，25℃诱导培养4h，离心10min(8000r/min，4℃)收集菌体，参加30mL20mmol/LTrispH8.0重悬菌体，200W超声破碎(超声5s，间隔8s)60次，低温高速离心30min(12000r/min，4℃)收集上清。1.2.3蛋白表示出产物纯化和分析上清中重组蛋白与Ni-NTA结合，由含有50mmol/L咪唑的20mmol/LTrispH8.0进行完全洗涤，最后由含有300mmol/L咪唑的20mmol/LTrispH8.0洗脱蛋白。纯化经过中，收集穿柱液(Flowthrough)、洗涤液(Wash)、洗脱液(Elution)，并各取出20L，参加5L的5XSDS上样缓冲液，100℃水浴10min，取适量样品经12%SDS电泳后进行染色和脱色分析。样品经12%SDS凝胶电泳后进行恒流电转移，转移到PVDF膜，以6his组氨酸标签作为检测抗原，对表示出的融合蛋白进行Westernblot来进一步检测，详细方式方法参照Invitrogen操作手册。1.2.4重组蛋白二级构造测定实验中采用CD测定所有蛋白的二级构造，均使用上海交通大学分析测试中心的JASCOJ-815圆二色谱仪。终浓度为0.1g/L的重组蛋白R1R2和R1R2CT分别溶于pH5.5、6.5和7.5的PBS磷酸盐溶液中，从190～260nm的波长范围收集信号，测试所用比色皿大小为1mm。1.2.5扫描电子显微镜测试分析终浓度为10mol/L的重组蛋白R1R2和R1R2CT分别溶于6种不同pH和盐离子的溶液中:20mmol/LPBSpH5.5、20mmol/LPBSpH6.5、20mmol/LPBSpH7.5、20mmol/LPBSpH5.5(含有154mmol/LNaCl)、20mmol/LPBSpH6.5(含有154mmol/LNaCl)、20mmol/LPBSpH7.5(含有154mmol/LNaCl)，于37℃250r/min震荡培养12h，培养液(纤维)由东华大学化学化工与生物工程学院日立TM-1000台式扫描电镜测试分析。2结果2.1重组子的鉴定R1R2和R1R2CT分别与经改造的载体pHTH连接，重组子质粒送上海生工生物工程有限公司正反向测序，测序结果经比对和分析确定无突变，可用于后续的重组蛋白表示出。2.2重组蛋白表示出和纯化R1和R2主要由甘氨酸(Glycine)和丙氨酸(Alanine)组成，CT序列中Gly和Ala较少，R1R2和R1R2CT的氨基酸序列见图2。超声破碎经IPTG诱导表达的R1R2和R1R2CTRosetta2(DE3)菌体，高速离心后的上清由Ni-NTA柱纯化(Qiagen纯化方式方法)。目的蛋白与Ni-NTA结合效率较高，洗脱后重组蛋白由SDS检测，图谱显示目的蛋白可到达较好的纯度(图3A、B);Westernblotting图谱进一步证明重组蛋白的大小和完好性(图3C)。2.3二级构造测定我们采用CD技术分别测定于pH7.5、6.5和5.5的PBS溶液中重组蛋白R1R2和R1R2CT的二级构造特征。R1R2在3种不同的pH中构造类似，主要为无规卷曲构象(图4)。R1R2CT在208nm和222nm处呈现负峰，是典型的螺旋峰型(图5)。我们的NMR结果证实CT为五螺旋构造，且随着pH值的降低，峰值信号向上偏移(未发表)。2.4扫描电镜分析重组模块蛋白R1R2、R1R2CT分别溶于6种不同pH值和离子条件下的溶液中：20mmol/LPBSpH5.5、20mmol/LPBSpH6.5、20mmol/LPBSpH7.5、20mmol/LPBSpH5.5+154mmol/LNaCl、20mmol/LPBSpH6.5+154mmol/LNaCl、20mmol/LPBSpH7.5+154mmol/LNaCl，终浓度为10mol/L.蛋白溶液经250r/min，37℃震荡培养12h后，电镜结果显示，R1R2和R1R2CT在pH7.5和pH6.5条件下均无可见的纤维产生。pH5.5时，R1R2CT构成纤维束，外表形态光滑、形态整洁;而R1R2则构成较为松懈的纤维，外表较为粗糙，呈扁平条带状。参加154mmol/L氯化钠后，R1R2CT外表粗糙，蛋白聚集不均匀，构成纤维形态较差;RIR2构成的纤维量较少，但形态与无氯化钠类似，外表形态较无氯化钠时粗糙且不平整。3讨论蛛丝蛋白由蜘蛛腹部腺体分泌产生，如MaSp由主壶腹腺分泌、MiSp由次壶腹腺分泌以及鞭毛状丝蛋白(Flag)由鞭毛状腺分泌等，主壶腹腺和次壶腹腺构造类似。蛛丝蛋白在纤维化经过中pH值从7.6降到6.3(当下可测定的最低pH值)，同时离子浓度和种类亦发生变化，最后在剪切力作用下构成高品质的丝纤维。2007年，PloSONE报道了首条MaSp全长基因组序列，蛋白序列分析表示清楚，MaSp由NT、CT以及占到95%以上的重复区R组成条MiSp全长基因组序列，与MaSp类似，MiSp亦由NT、CT和R组成，R占主要部分。6种蛛丝纤维分别拥有不同的机械性能，主要由不同的重复区R决定；NT和CT在蛛丝蛋白的成丝经过中主要起到调节、促溶以及利于纤维蛋白排列等作用。MiSp重复区域R主要由poly-Alanine(polyA)，Glycine-Glycine-X(X为其他氨基酸，GGX)以及Glycine-Alanine(GA)等模块组成，组成的次壶腹腺丝拥有类似拖丝的机械性能。构造分析发现，polyA和GA均能构成-sheet构造，在固态丝纤维中整洁排列构成晶体区域，决定丝素蛋白的强度。GGX构成310-helix，构成丝纤维的无定型区域，决定丝纤维的延展性能。另外，MiSp中还带有特殊的Spacer区域，但到当前为止，该模块的功能尚不清楚，我们揣测该模块与延展性相关。在自然进化中，重复区变化较大，但是CT在序列和构造上高度保守，研究发现MaSpCT能够稳定丝蛋白，阻止过早的聚集，并且能够调整重复区的排列而构成外表形态更好的丝纤维。2018年，NATURE报道了MaSpCT的高级构造，解释了它在溶液中的构造形态和它与丝蛋白储存和自组装转变的密切相关性。另外，MaSpCT在调整重复区R二级构造方面扮演着重要的角色，这对于丝纤维的机械性能具有很重要的作用。为了进一步研究R和CT模块的功能，我们构建了R1R2和R1R2CT两个重组克隆。通过BsaⅠ限制性内切酶的介导，我们将R1和R2以及CT三段无缝连接(图2)，排除了由酶切位点引入外源氨基酸的干扰。由于R1、R2以及CT中均含有稀有密码子，因而我们选择Rosetta2(DE3)作为表示出宿主菌体来消除稀有密码子的影响。表示出及纯化结果表示清楚(图3)，重组蛋白R1R2和R1R2CT均可在Rosetta2(DE3)中大量表示出，采用Ni-NTA纯化柱纯化可得到纯度较高的重组蛋白(图3)。Westernblotting结果也证实了重组蛋白R1R2和R1R2CT的完好性和纯度。R1R2主要由ploy-A、GA以及GGX组成，CD图谱显示(图4和5)，R1R2重组蛋白在PBS溶液中主要为无规卷曲构象，R1R2CT则拥有螺旋的两个特征负峰值。我们的其他实验数据表示清楚，MiSpCT为五螺旋构象，随着pH的降低，峰图向上偏移，表示清楚二级构造出现细微的变化(未发表)。R1R2为无规卷曲，R1R2CT为螺旋构象，我们揣测CT能够促进重复区螺旋等构象的构成。我们在3种不同的pH值及有无154mmol/LNaCl的条件下，37℃250r/min震荡培养上述两种重组蛋白12h，样品经SEM分析(图6)表示清楚，在pH7.5和6.5时，R1R2CT和R1R2均无法构成纤维，pH值降到5.5时，可构成纤维。R1R2CT可构成外表形态良好的重组纤维，且纤维成纤维束状(图6中显示为4根单纤维的混合)，单根纤维外表光滑，呈立体圆形，大小均匀。只要重复区的R1R2重组蛋白则不同，构成的纤维为扁平带状，大小不均匀。文献记载MaSp重复区R重组蛋白无法构成纤维，只要加上CT后才能构成可见纤维。通过本实验，我们证实单独的MiSpR1R2重组蛋白可以构成纤维，只是纤维形态较R1R2CT不平整，呈条带状。因而，CT有利于丝蛋白的排列组装而构成较为严密的重组纤维。NaCl能够维持MaSpNT单体稳定性，不利于丝蛋白的纤维化。这里我们进一步证实，在154mmol/LNaCl存在的条件下，R1R2和R1R2CT均可构成纤维，但构成纤维形态不均匀，无法呈现出立体圆形。本次研究通过对R1R2和R1R2CT的表示出、纯化以及二级构造和成丝倾向的分析，证实了在不同pH值的PBS中R1R2为无规卷曲构象，而R1R2CT则主要为螺旋构象。pH值6.5～7.5不利于丝素蛋白的纤维化，pH值为5.5时，纤维化形态较好。另外，我们还分析了NaCl对成丝的影响，结果表示清楚NaCl不利于高品质纤维的构成。本研究为成丝机理的研究以及通过基因工程方式方法仿生蜘蛛丝奠定了基础。以下为参考文献(References):[1]GILMANJJ.Strengthofspidersilk[J].Science,1996,272(5258):17a.[2]VOLLRATHF.Strengthandstructureofspiderssilks[J].Jour－nalofBiotechnology,2000,74(2):67-83.[3]LEWISRV.Spidersilk:ancientideasfornewbiomaterials[J].ChemicalReviews,2006,106(9):3762-3774.[4]KLUGEJA,RABOTYAGOVAO,LEISKGG,etal.Spidersilksandtheirapplications[J].TrendsinBiotechnology,2008,26(5):244-251.[5]RISINGA.Controlledassembly-aprerequisitefortheuseofrecombinantspidersilkinregenerativemedicine?[EB/OL].ActaBiomaterialia[6]HAUPTMANNV,WEICHERTN,MENZELM,etal.Native-sizedspidersilkproteinssynthesizedinplantaviaintein-basedmultimerization[J].TransgenicResearch,2020,22(2):369-377.[7]XIAXX,QIANZG,CSKI,etal.Native-sizedrecombinantspidersilkproteinproducedinmetabolicallyengineeredEs－cherichiacoliresultsinastrongfiber[J].ProceedingsoftheNa－tionalAcademyofSciencesofUSA,2018,107(32):14059-14063.[8]AYOUBNA,GARBJE,KUELBSA,etal.Ancientproper－tiesofspidersilksrevealedbythecompletegenesequenceoftheprey-wrappingsilkprotein(AcSp1)[J].MolecularBiologyandEvolution,2020,30(3):589-601.[9]CHENG,LIUX,ZHANGY,etal.Full-lengthminorampul－latespidroingenesequence[J].PLoSone,2020,7(12):e52293.[10]AYOUBNA,GARBJE,TINGHITELLARM,etal.Blueprintforahigh-performancebiomaterial:full-lengthspiderdraglinesilkgenes[J].PLoSone,2007,2(6):e514.[11]HAGNF.Astructuralviewonspidersilkproteinsandtheirroleinfiberassembly[J].JournalofPeptideScience,2020,18(6):357-365.[12]GAINESWA,SEHORNMG,MARCOTTEWR.SpidroinN-terminaldomainpromotesapH-dependentassociationofsilkproteinsduringself-assembly[J].TheJournalofBiologicalChemistry,2018,285(52):40745-40753.[13]ANDERSSONM,HOLML,RIDDERSTRALEY,etal.Mor－phologyandcompositionofthespidermajorampullateglandanddraglinesilk[J].Biomacromolecules,2020,14(8):2945-2952.[14]HAGNF,EISOLDTL,HARDYJG,etal.Aconservedspidersilkdomainactsasamolecularswitchthatcontrolsfibreas－sembly[J].Nature,2018,465(7295):239-242.[15]VOLLRATHF.Biologyofspidersilk[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,1999,24(2-3):81-88.。[16]JEFFERYF,LAMATTINAC,TUTON-BLASINGAMET,etal.Microdissectionofblackwidowspidersilk-producingglands[J].JournalofVisualizedExperiments(VideoJournal),2018,(47):2382.[17]ORTIZR,CESPEDESW,NIEVESL,etal.SmallampullateglandsofNephilaclavipes[J].TheJournalofExperimentalZo－ology,2000,286(2):114-119.[18]EISOLDTL,THAMMC,SCHEIBELT.Reviewtheroleofterminaldomainsduringstorageandassemblyofspidersilkproteins[J].Biopolymers,2020,97(6):355-361.[19]HUDSPETHM,NIEX,CHENW,etal.Effectofloadingrateonmechanicalpropertiesandfracturemorphologyofspidersilk[J].Biomacromolecules,2020,13(8):2240-2246.[20]JENKINSJE,SAMPATHS,BUTLERE,etal.Characterizingthesecondaryproteinstructureofblackwidowdraglinesilkusingsolid-stateNMRX-raydiffraction[J].Biomacromolecules,2020,14(10):3472-3483.[21]PARKHEAD,SEELEYSK,GARDNERK,et