凝血因子Ⅻ 46 CT多态性一家系报道及相关文献

凝血因子Ⅻ46C/T多态性一家系报道及相关文献【摘要】目的对1个表型诊断为f?缺乏的家系进展基因诊断。方法检测先证者及其父母的血浆f?:，以其外周血单个核细胞中提取的基因组dna为模板，pr扩增f12基因的全部外显子及其侧翼序列，pr产物纯化后直接测序。结果先证者及其父、母f?:分别是52.5%、78.6%、89%，直接测序结果提示先证者f12基因的第1外显子46位碱基即启动子上游-4位为t/t基因型，其父、母在该位点均为/t基因型。该基因的其它编码序列和侧翼部位未发现有碱基改变。结论f12基因的46t/t多态性可能是导致先证者f?缺乏的原因。【关键词】凝血因子?;基因;多态性;家系analysisftheagulatinfatr?46/tplyrphisinapedigreeandrelatedliteraturerevie(departentfheatlgy,theaffiliateddruterhspital,nanjinguniversityedialshl,nanjing，210008,hina)keyrds：agulatinfatr?;gene;plyrphis;pedigree凝血因子?(agulatinfatr?，f?)即hagean因子，是一种丝氨酸蛋白酶，主要由肝脏合成，参与内源性凝血途径的接触相激活。遗传性f?缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，患者常表现为aptt延长但在临床上常无出血病症。本文对1个表型诊断为f?缺乏的家系进展了基因诊断并就f?在血栓形成中的作用进展文献复习。1资料与方法1.1家系资料先证者，男，8岁，因"皮肤瘀点、瘀斑1周"就诊。患者无明显诱因出现右上肢皮肤瘀点、瘀斑1周，凝血象检查发现aptt67s，正常血浆混合试验aptt32s。患者父母非近亲结婚，家族中无类似病史。先证者及其父母肝功能检查正常。1.2血标本的采集、处理和dna制备先证者及其父、母采集外周静脉血，枸橼酸钠抗凝，4℃4000r/in离心15in后别离乏血小板血浆，分装后-80℃保存，用于凝血指标的测定。外周血单个核细胞按常规酚-氯仿法抽提基因组dna，用于pr扩增。1.4引物设计根据f?基因序列(genbankaf538691)，参照文献[1]，应用prier5软件共设计7对引物以覆盖该基因的全部外显子区域及其侧翼序列。引物由上海申能博彩生物科技产品合成。1.5pr扩增50μlpr反响体系包括：1×pr缓冲液，1.5l/lgl2，0.25l/ldntps，引物终浓度0.5μl/l，500ngdna模板，2.5utaqdna聚合酶(pr反响试剂均为上海申能博彩生物工程公司产品)。pr反响在abi2720dna热循环仪上进展，反响条件：95℃预变性5in，然后95℃变性30s，根据引物的不同分别在相应的退火温度退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10in。pr产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，dl2000标记pr产物大校1.6pr产物的纯化和测序分析pr产物进展割胶纯化(申能博彩pr产物胶回收纯化试剂盒)，以制备测序模板，采用双脱氧链终止法在abi3130测序仪上进展测序，用hras软件将测序结果与美国nbi基因库公布的f?基因序列(genebankaf538691)进展比对，寻找基因突变。发现基因突变的序列那么反向测序予以证实。2结果2.1表型检测先证者凝血象检查显示aptt、pt、tt分别为67s(参考值29～43s)、12.6s(11～14s)、20.0s(14～20s)，fbg3.2g/l(2.0～4.0g/l)，正常血浆混合试验aptt32s。各种凝血因子活性检测显示fⅷ:91%，fⅸ:94.0%，f?:70.0%，f?:52.5%，fⅴ:99.6%，fⅹ:82.1%(上述各因子活性正常参考值均为50%～150%)。其父亲aptt、pt、tt、fbg、f?:分别为37.5s、11.7s、18s、3.8g/l、78.6%，其母亲aptt、pt、tt、fbg、f?:分别为35.9s、11.6s、17.5s、2.2g/l、89%。2.2f?基因分析对先证者f?基因的所有14个外显子全部区域及其侧翼序列pr产物进展测序，结果发现先证者在f?基因第1外显子46位碱基即启动子上游-4位为t/t基因型。该基因的其它编码序列和侧翼部位未发现有碱基改变。其父亲、母亲的f12基因在该位点均为/t基因型。测序结果见图1。图1f?基因外显子1部分测序结果3讨论本文中的先证者因无诱因出现皮肤瘀斑，凝血象检查发现aptt延长而正常混合血浆试验能纠正，说明是内源性凝血途径的凝血因子活性缺乏;各种凝血因子活性检查提示仅f?:52.5%为正常参考值的低值，其余凝血因子活性均在正常参考范围，显示是f?:降低导致aptt延长;基因测序提示f?基因外显子1的第46位碱基为t/t基因型，其父、母那么为/t基因型，提示先证者的基因型为遗传所致。研究说明，在f?基因5'端非翻译区、atg起始密码子的上游4个碱基处的46/t基因型为多态性位点。当被t交换后，产生了一个新的atg起始密码子，如图2所示。按照kzak理论[3]，一方面由于新的起始密码子所存在的部位不是最正确起始位点，基因调控使得核糖体蛋白跳过新的起始密码子而与原起始密码子相结合以启动转录;另一方面，由于从新的起始密码子开场转录后可在其后的第7个碱基处出现终止密码子(tga)而使蛋白转录终止，40srna可在下游重新定位后开场新的转录过程。因此，从理论上推测，被t交换后引起f?活性减低。图2f?基因外显子146/t改变kanaji等[1]的研究显示46位或t对f?基因的转录及其rna的稳定性无影响，但与46相比，46t时rna的翻译显著降低，提示t/t基因型因显著降低f?基因的翻译效能而减少f?蛋白的合成;对安康人群血浆f?程度的研究显示，46/、/t、t/t基因型时的f?活性分别为170±38%、141±29%、82±19%，f?抗原分别为176±27%、123±34%、61±11%，并发现该部位/t多态性位点在东方人群中的等位基因频率为0.27/0.73，而在高加索人中为0.8/0.2。高加索人群的f?活性较东方人为高可能就是这个多态性位点频率低的缘故。endler1等[4]对100例奥地利新生儿进展了研究，发现f?基因46/基因型占64%，/t占29%，t/t占7%;对80例aptt延长的患者(排除凝血因子ⅷ、ⅸ和?等缺乏)进展的研究显示具有46/等位基因的患者其f?活性为1.17u/l、/t者为0.70u/l、t/t为0.44u/l。bah等[5]对2615例进展冠脉血管造影的德国人进展的46/t等位基因的检查，发现/基因型占57%、/t基因型占38%,t/t基因型占5%，对f?活性及活化的f?程度的研究也证实了以上两个研究结果。故t/t基因型f?的蛋白表达量显著低于/基因型f?的蛋白表达量。国内王学锋等[6]在研究2个遗传性凝血因子?缺陷症家系f?基因突变时也发现含有t/t基因型的先证者其f?活性也较/t基因型的为低。本文中的先证者经基因测序为46t/t基因型，其父、母均为46/t基因型，故其f?活性较其父、母的低。尽管f?在内源性凝血途径的启动环节中可能有重要作用，但其缺乏在临床上却无明显的出血，仅表现为aptt延长。相反，许多报道发现f?缺乏与血栓栓塞性疾病的发病有关，认为f?缺乏是血栓栓塞性疾病的发病风险之一。santaara等[7]对205例西班牙裔缺血性脑中风患者进展的f?基因46/t多态性研究，发现46/基因型者f?活性为127.6%,/t基因型为95.2%,t/t基因型为57.9%，46t/t基因型在患者中占5.9%，正常对照占1.3%，认为46t/t基因型是缺血性脑中风的风险因素;reuner等[8]对78例德国裔脑静脉血栓形成患者的病因研究，发现46t/t基因型在患者中占16.7%，而正常对照仅占5.5%，提示46t/t基因型是脑静脉血栓形成的独立危险因子。假如单从f?缺乏的角度出发(即无论何种原因导致f?缺乏)，有许多报道已发现类似的结果。halbayer等[9]报道f?缺乏与心肌梗死的发生、开展具有相关性。kuhli等[10]报道在≤45岁的视网膜静脉阻塞的患者中，f?缺乏与其发病具有高度相关性。pauer等[11]报道f?缺乏与原发性习惯性流产具有高度相关性。f?缺乏易致血栓形成的机制可能与f?通过直接及间接途径激活纤溶系统、导致纤维蛋白溶解有关[12]。f?活性减低，那么不能有效激活纤溶系统，易致血栓形成。但是，也有不支持f?易致血栓形成的报道，guhi等[13]报道ff?基因46/t多态性与冠心并静脉血栓栓塞性疾并中风等无相关性。renn等[14]报道在f?缺乏的小鼠模型中，动脉血栓形成被明显削弱，但没有过度出血表现;kleinshnit