急性毒性试验

2023/2/251实验动物与动物实验——第1讲

急性毒性试验№1.Acutetoxicitytest

2023/2/252第一节

概念和意义一、基本概念急性毒性：指24h内单次或多次大剂量给予某药物所出现的有害作用，亦即快速而剧烈的中毒反应。急性毒性试验：以观察急性毒性为目的而设计的一种毒理学试验，急性毒性试验以阐明药物的剂量-毒效关系为出发点，为全面毒性试验打下基础。2023/2/253内容定性———毒性反应出现和消失时间、可能的靶器官和死亡原因等；定量———致死量、最大给药量、半数致死量等。目的和意义测定LD50及相关参数，初步估计毒性大小；观察急性中毒症状，推测毒性靶器官；为长期毒性试验和特殊毒性试验的剂量设计提供参考；为早期判断研发价值提供资料。二、急性毒性试验的内容、目的和意义2023/2/254三、LD50的测定及统计学原理LD50的概念

1）能引起一群实验动物50%死亡所需的剂量，2）是某药物预期引起50%死亡的统计学剂量。

是一个有置信限估计的中介值，

是反映药物毒效应的上限指标，是药物急性毒性分级依据。2023/2/255LD50

值的作用及意义LD50是药物的特征性参数之一，用来判断毒性程度。有助于计算毒性参数。

急性毒作用带（Zac）；治疗指数TI（LD50/ED50）；安全指数SI（LD5/ED5）；可靠安全系数CSF（LD1/ED99）。Zac=LD50Limac以LD50与急性毒性最小有作用剂量(阈剂量，Limac)的比值来表示（是药物毒性上限指标与下限指标的比值）。(1)急性毒作用带（Zac）

Zac大小反应了急性毒性阈剂量与LD50的距离，越大，说明药物引起死亡的危险性越小；越小，则引起死亡的危险性越大。

TI=半数致死量（LD50）半数有效量（ED50）

TI是指半数致死量与半数有效量之比值。（2）治疗指数（Therapeuticindex,TI）

TI值越大,越安全

,一般认为TI大于3的药物才可能具有实用意义。

目前用于临床的药物,其TI值大多大于10。SI=LD5ED95SI是指基本无害量与基本有效量之比值。（3）安全指数（Safetyindex，SI）

SI值可以说明药物的临床安全性，但该值往往难以精确计算出来，测定误差很大。2023/2/259CSF=LD1ED99CSF是指肯定无害量与肯定有效量之比值。（4）可靠安全系数（Certainsafetyfactor，CSF）

CSF值可以说明药物的临床安全性，CSF越大，越安全。毒性分级大鼠一次经口LD50(mg·kg体重-1)6只大鼠吸入4小时,死亡2-4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(mg·kg体重-1)对人可能致死的估计量g·kg体重-1g·60kg体重-1剧毒﹤1﹤10﹤5﹤0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250微毒5000~10000~2180~﹥15﹥1000表1-1化学异物急性毒性分级（WHO）

小鼠LD50（mg/kg体重）口服皮下注射静脉或腹腔注射毒药﹤30﹤20﹤10剧药﹤300﹤200﹤100普通药﹥300﹥200﹥100表1-2毒药、剧药按LD50值的划分药物急性毒性分级2023/2/2511LD50

绝非判断药物急性毒性的惟一指标仅是一个统计学术语是许多反映药物急性毒性的参数之一。急性毒性作用具有比LD50更为深刻的内涵，剂量-效应（死亡）曲线的斜率比LD50

更有价值甚至更为关键。LD50

及相关参数的缺陷2023/2/2512动物消耗量大,获得的信息有限；影响LD50值的因素较多，比如动物的种类、品系、年龄、性别、健康状况等；从安全性评价角度来讲，需要的不是精确的LD50值，而是更多的毒性信息。LD50

测定的明显不足2023/2/2513四、非致死性毒性反应及其转归

非致死性（毒性）反应：试验中有些动物幸免于致死，但存在不可逆的损伤。非致死性有害反应与致死性反应仅仅是程度上的差异，都是用药过程中不希望出现的。非致死性毒性反应的转归——是否可逆反应是否可逆主要取决于:

●

毒性作用涉及的器官与系统

●

药物的内在毒性

●

用药时间的长短

●

在确定的时间范围内，药物在体内的量

●

动物的年龄和健康状况如在动物中观察到不可逆反应，则应注意外推至人时是否存在。2023/2/2515第二节

试验设计及方法一、基本要求两种动物小动物—LD50、最大耐受量试验大动物—单次给药的近似致死量和最大耐受量两种给药途径—其中一种必须与临床用药途径相同试验周期—7-14天LD50计算方法—Bliss法必要时可增加一个溶媒对照组实验条件及方法必须规范化表1-3各国对急性毒性试验的基本要求FDA日本美国英国前西德欧盟俄罗斯WHO瑞士动物种类3-4

2

3

2

2

2

2

3

2给药途径

1

3

3

2

2

2

2

3

22023/2/2517二、实验动物

动物选择的原则：●

尽量选择急性毒性反应与人近似的动物；●

易于饲养管理、试验操作方便的动物；●

繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应；●

价格较低，易于获得的动物。2023/2/2518二、实验动物

在基础性研究工作中按科研课题的具体要求选择，在法规性毒理学评价工作中，必须按照其规范要求进行。无论使用何种动物都必须注明动物的来源、品系、年龄、体重、性别、饲养条件以及动物生产合格证书。如系无特殊病原体动物也应在报告中注明。2023/2/2519二、实验动物

种类小鼠、大鼠、犬、猴、家兔（经口给药不用）下列情况考虑选用非啮齿类动物大鼠、小鼠LD50差别明显；药物药动学在啮齿类与非啮齿类之间存在明显差异；为了得到明确的毒效表现，初步了解药物的特性后，在条件许可的情况下可考虑选用其他敏感动物。2023/2/2520二、实验动物

健康状况：健康动物体重与年龄同一批实验中，动物的年龄、体重应尽可能一致；原则上选用年轻成年动物，啮齿类动物的年龄一般为7~9周龄，非啮齿类动物起始为6~8月龄；同一批试验中，动物的初始体重变异要求不超过平均体重的±20%。(同一组最大组与最小组差异不得超过20%、组间变异不应超过10%）表1-4常用实验动物的生活年限及体重选择动物生活年成年体重选择范围（g）种类限（年）时间(月)体重(g)急性实验长期性实验小鼠1.5~221518~2515~18大鼠2~2.53150150~24050~100豚鼠6~82250200~250150~200家兔4~93~415001500~20001200~1500狗10~203~4-8000~150004000~60002023/2/2522二、实验动物

性别急性毒性试验中应考虑雌雄动物数目相等；但在试验中如发现某性别动物的死亡率明显高于另一性别时，则最好对该性别的LD50

另外计算，或考虑选用敏感性别的动物重新进行急性毒性试验。2023/2/2523二、实验动物

动物分组方法动物应随机分配至各剂量组；随机分组可使动物形成一个均匀的整体，并可减少因个体差异而造成的误差;体重或健康状况不符合要求的动物应在随机分组前剔除。随机分组按体重分区组：≤18g、18～20g、20～22g、22～24g、24～26g、≥26g.再将这7组分入各组中。2023/2/2524二、实验动物

动物给药前禁食处理经口途径染毒，在试验前应作禁食处理。大鼠主要在夜间进食，要求染毒前应隔夜禁食。小鼠由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁食4小时以上。大动物常前一天正常给食，染毒前不喂食即可。禁食期间均正常给水。染毒2小时后提供饲料。经口多次染毒，可不禁食。2023/2/2525三、剂量水平的选择剂量水平的选择以测定LD50及剂量-反应曲线的斜率为目的（10%-50%-90%）；4上以上剂量，至少有3个落在10%-90%之间；做预试验来摸索剂量通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期毒性中值；对全新结构的药物或中草药复方，可先通过小批量动物摸索，找出Dmin和Dmax。2023/2/2526▲

已知结构的药物——确定预期毒性中值

对于己了解化学结构的药物，在确定其所属化学类别及其所含的特殊基团的基础上，查阅有关文献，找出与药物结构近似或有共性基团的药物的毒性资料；其次最好能了解药物的理化性质，最后综合考虑这两方面的资料，选择与药物的化学结构和理化性质最为接近的己知药物的LD50

作为药物的预期毒性中值。理论依据：构效关系2023/2/2527确定预期毒性中值（LD50）后，以此值为中间剂量，再以该中间剂量值为基准，按一定的组间距上下各推二个剂量，作为预试验的剂量分组。

预试时，组间距可稍大些，i

值可取0.6，相邻剂量比为1:4。如果估计药物的致死剂量范围较窄，组间距可适当缩小，i

值取0.2，相邻剂量比为1:1.6。组间距i

值，剂量的对数值等差分布，剂量等比分布▲

已知结构的药物——确定预期毒性中值通过预试找出药物使10%-90%实验动物死亡剂量的大致范围,再据此确定正式试验的具体分组方案,此时可按下式求算组间距（i

值）。

或

i

=logLD90-logLD10n-1

i

=logLD100-logLD0n-1▲

已知结构的药物——确定预期毒性中值2023/2/2529▲

全新结构药物或中草药复方——确定极值

先通过小批量动物的摸索，找出0%及100%估计致死量(即Dmin和Dmax)，再求出

i值。

(1)用10倍稀释的药物浓度系列，用少量动物（每组2-3只），找出大致死亡范围。

剂量死亡数/动物数5mg/kg

0/250mg/kg1/2

500mg/kg2/25000mg/kg2/2上述结果提示

,大致死亡范围为50mg/kg-500mg/kg。(2)再用1、2、4、8………等2

倍稀释的药物浓度每组4只动物实验，找出Dmin和Dmax。▲

全新结构药物或中草药复方——确定极值当出现4/4死亡时，如其前一组为3/4死亡，则取4/4组的剂量为Dmax，如前一组为2/4或1/4死亡(如本例为2/4)，考虑到4/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率低于70%，为慎重起见，可将4/4组的剂量乘以2作为Dmax；当出现0/4死亡时，如其后一组的死亡率为1/4，则取0/4组的剂量为Dmin，如后一组死亡率大于1/4，考虑到0/4组的剂量在正式实验中可能的死亡率高于70%，则将0/4组的剂量除以2，作为Dmin。

剂量死亡数/动物数

50mg/kg0/4*

100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4Dmin=50÷70%÷2≈35（mg/kg）Dmax

=

400×70%×2

=

560（mg/kg）

剂量死亡数/动物数

50mg/kg0/4*

100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4Dmax：当出现4/4死亡时,如前一组死亡率为2/4时Dmax=4/4死亡剂量×1.4()=400×1.4=560（mg/kg）Dmin：当出现0/4死亡时，如后一组死亡率大于1/4Dmin=0/4死亡剂量÷1.4()=50÷1.4≈35（mg/kg）陈奇：《中药药理研究方法学》第3版在确定了Dmax和Dmin以后，可求得组间距（i值):以Dmin的对数为起点，向上推出n

组动物的各组剂量的对数值，求出反对数即可求得各组的剂量。

i

=logDmax-logDminn-1求组间距（i值):2023/2/2533四、剂量组数及动物数LD50

测定中剂量组数的设计，除符合统计学要求外，还应根据预试验所提供的药物的毒性情况而定；一般而言，在实际工作中设4~5个剂量组，剂距以0.65~0.85为宜；小鼠每组10只(雌雄各半)，大鼠不应少于6~8只。2023/2/2534五、剂型与给药应写明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。供试药品应能溶于或混悬于适当的溶媒，如果溶媒的毒性情况是未知的，则应设立一个溶媒对照组，溶媒对照组的给药容量应与最高剂量组相等。对所用溶媒及助溶剂须有详细记录，以备分析和审核。给药途径要用2种，其中应包括推荐临床研究的给药途径。溶于水的药物应当测定静脉给药途径的急性毒性，口服药物应灌胃给药。药物可以等体积（各剂量组的药物浓度不同）或等浓度（各剂量组的给药体积不同）给药，但必须注意上述两种方式给药所观察到的毒性效应可能是不尽相同的。2023/2/2535五、剂型与给药给药的体积，啮齿类动物口服给药的最大的体积，对非水溶液而言以不超过10ml/kg为宜，水溶液或混悬液一般不超过20ml/kg。如果剂量较大而不便于一次给药，可以分成相等的容量，每隔6~8小时给药，但必须在第一次给药后的24小时内完成。口服给药应禁食；静注给药应注意药液的pH值、温度、渗透压、注射速度等可能影响毒效应的各种因素。动物给药途径常用容量最大容量小鼠ig0.2ml/20g1.0ml/20giv0.2ml/20g0.5ml/20gip0.2ml/20g1.0ml/20gsc0.1ml/20g0.5ml/20gim0.1ml/20g0.2ml/20g表1-6急性毒性试验常用动物单次给药的常用容量和最大容量大鼠ig

1.0ml/200g

3.0ml/200giv

0.5ml/200g

1.0ml/200gip

1.0ml/200g

3.0ml/200gsc

0.5ml/200g

1.0ml/200g狗im

0.2ml/200g

0.5ml/200gig

10ml/只

20ml/只iv

35ml/只

50ml/只2023/2/2537六、试验时限与量限

急性毒性试验的观察时间取决于症状出现的时间、毒性强弱、致死速度、恢复速率以及药物本身的代谢特征等。我国新药审批办法规定：急性毒性试验必须观察7~14d，但一般不必超过2wk（14d）。在表示药物的LD50

时最好同时注明观察时间，这样在毒性比较时，才会有共同的基础。在实际工作中，对于毒性低的药物可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24h内分次给药，一般使用20只啮齿类动物，连续观察7~14d，如无死亡出现，则该剂量即为药物的最大耐受剂量。药液配制的具体步骤：等比稀释溶液：各小鼠给药容积一样=0.1ml/10g预试中Dm=344mg/kg，Dn=141mg/kg，算出r=1.25，小鼠的平均体重为20g，每组10只，用药量为0.1ml/10g=10ml/kgC1=344mg/kg/10ml/kg=34.4mg/ml每组药液量=每组动物总重×用药量=200g×0.1ml/10g=2ml1号2号3号4号5号1号液2号液3号液4号液5号液2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2023/2/2539七、观察指标目的：找出毒性作用的特征，初步获得药物毒效应的靶器官和受试动物的死亡原因。内容：

笼边观察

特别要注意给药后６h内动物中毒症状及死亡情况。观察的时间间隔及频度必须根据症状出现、恢复、变化及死亡时间而定，一般给药后持续观察30min，第1~

4h再观察1次，以后每天观察1次。2023/2/2540中毒部位毒性症状表现中枢神经及运动神经系统自发活动减少或增加，嗜睡，翻正反射消失，舔毛，噪动，僵持，震颤，惊厥，共济失调，异常运动等植物神经系统瞳孔放大或缩小，腺体分泌增加，流涎，竖毛，共济失调，肌张力增强或减弱呼吸系统鼻孔分泌物，呼吸急促，呼吸缓慢，腹式呼吸，喘息，窒息，紫绀等心血管系统心动过速，心动过缓，血管扩张或收缩，心输出改变，心律失常等胃肠道系统粪便坚硬，干燥，量少，便秘，腹泻，水样便，呕吐，恶心，干呕等泌尿系统血尿，多尿等眼睛流泪，眼球突出，上睑下垂，血性泪液，眨眼（瞬膜反射），角膜浑浊，虹膜炎，结膜炎等皮肤、被毛水肿，发红，皮疹，炎症，被毛竖立，色黄等表1-7急性毒性试验中的一般毒性症状观察

2023/2/2541七、观察指标死亡过程与死亡时间

药物的毒效应是不同的，毒性作用（反应）出现的先后次序以及是否出现都可体现毒效应的差异。致死所需的时间和所需的剂量都是衡量药物毒性强弱的依据。

死亡时间也可间接地反映药物毒作用性质的信息。2023/2/2542七、观察指标体重

给药前、给药期间（每天或根据需要确定间隔）、动物死亡时及实验终止时必须对每个动物进行称重，观察药物对动物体重的影响。

引起体重减轻或增长率减慢的原因较为复杂因此，体重的变化要在全面观察的基础上仔细地加以分析。2023/2/2543七、观察指标

尸体解剖及病理组织学检查

对于濒死的或己死亡的动物以及实验终止时尚存活的动物必须进行系统的尸体解剖检查。

病理组织学检查并非必要的检查项目。但是对于迟发死亡动物，尤其是发生“双峰”死亡现象时，应进行病理组织学检查，以便为死因的确认提供依据。观察记录应尽量准确、具体、完整。不单记录死亡时间，还应记录具体的中毒表现，并应能表明出现的时间及持续的时间。2023/2/2544第三节

LD50计算方法一、孙氏改进寇氏法（点斜法）二、Bliss法2023/2/25451.基本要求反应情况应符合或接近对数正态分布；相邻两剂量的比值应相等；各组动物数相等或相近，一般为10只；不要求死亡率一定包括0%与100%，但二者之和最好在80%~120%范围内。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）2023/2/25462.计算公式

(1)当最小剂量组的死亡率为0

%,最大剂量组的死亡率为100%时，按下列公式计算：LD50=lg-1[Xm–i(∑P

-

0.5)]

…(1)

式中Xm

为最大剂量的对数；

p

为各组动物的死亡率(以小数表示)；

∑P为各组动物死亡率的总和(P1

十P２

+P3

……

)

i

为组间距(相邻两组对数剂量的差值)。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）2023/2/25472.计算公式

（2）当最小剂量组的死亡率大于0%而又小于30%，或最大剂量组的死亡率小于100%而又大于70%时：

式中Pm

为最大剂量组的死亡率;

Pn

为最小剂量组的死亡率。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）LD50=

lg-1[Xm-i(

∑P-3–Pm-Pn)]

…(2)42023/2/25482.计算公式

（3）LD50

的标准误差按下式计算:

式中Sx50

为lgLD50的标准误差；

X50即lgLD50；

n为每组动物数。一、孙氏改进寇氏法（点斜法）Sx50=i·(∑P-∑P2)

…(3)n-12023/2/25492.计算公式

（4）LD50的95%可信限按下式计算

一、孙氏改进寇氏法（点斜法）

95%可信限=

lg-1

(

X50±1.96Sx50

)…(4)2023/2/2550例题

取体重18-22g小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，按表1-8中剂量腹腔注射PAM溶液，组间剂量比为1:0.8，死亡率见表1-8，用改良寇氏法计算其半数致死量、标准误差和95%可信区间。

2023/2/2551按式（1）计算LD50

现Xm=2.48，i=0.10，∑P=2.6LD50=lg-1[Xm–i(∑P-0.5)]=lg-1[2.48–0.1(2.6-0.5)]=lg-12.27=186.21mg/kg2023/2/2552按式(3)计算LD50

的标准误差

现n=10，∑P2=1.98

Sx50=i·

(∑P-∑P2)n-1=

0.10·

2.6–1.9810-1=0.0069

2023/2/2553按式(4)计算LD50

的95%可信限95%可信限=

lg-1

(

X50

士1.96

Sx50

)

=lg-1

(

lg186.21

士1.96

×0.0069)=lg-1

(2.27

士0.0135)=lg-1

(2.2565~2.2835)=180.51~192.09mg/kg答：PAM对小鼠腹腔注射的LD