聚合酶链式反应PCR实验报告_第1页
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文档简介

实验二聚合酶链式反响（PCR）之勘阻及广创作一、实验原理聚合酶链式反响（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外迅速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳固的聚合酶，经过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延长的重复循环，DNA片段以指数方式增添了百万倍。从特别微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA开端，可发生ug量的PCR产品。二、器械与试剂器械：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪试剂：引物，模板，TaqDNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O,2*PCRmix溶液，DNA染料三、实验步伐PCR反响系统的成立取离心管，挨次加入试剂混匀1．H2O12μl2．模板1μl3．引物T71μl4．引物sp61μl5．2*PCRmix15μlPCR仪的热循环反响把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延长三个基本反响步伐组成模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一准时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物联合，为下轮反响作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对联合；3.引物的延长：经加热至

72℃左右

DNA模板

--

引物联合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以

dNTP

为反响原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。电泳检测结果扩增产品在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照耀仪中进行透射，电泳明胶显示清楚的条带，以下列图所示

加入的为

1号样，出此刻

500bp

左右条带，而估算结果为扩增出

492bp

条带，故实验成功。四、

议论Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的联合而降低PCR扩增效率。EB：溴化乙锭是一种高度敏捷的荧光染色剂，用于察看琼脂糖中的DNA，可与DNA联合，用尺度302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。4.溴酚蓝：电泳指示剂，相当于300bp的DNA的电泳速度。100bpDNAMarkerⅠ是由独自的PCR扩增产品混淆而成，已含有1xLoadingBuffer,能够直接电泳。包括11条双链DNA片断：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp。特异性增强500bp。每次上样4～5μL。模板一般采纳50ng-1ug或102--105拷贝，浓度过高反而会克制反响的进行。引物的与模板的互补程度决定了PCR的特异性，常常使用0.1—0.5uM，浓度

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