芴对斑马鱼不同发育时期的毒性作用对比,动物学论文

芴对斑马鱼不同发育时期的毒性作用对比,动物学论文芴(fluorene)是美国国家环境保卫局(USEPA)优先控制的16种多环芳烃(polycyclicaromatichydrocar-bons，PAHs)之一，是一种介于2环与3环之间的多环芳烃，主要来源于石油、木材、煤炭等的燃烧和海上石油开发运输中的泄漏。芴等多环芳烃会被水体中的悬浮颗粒物吸附，进而大量沉积在水底，但由于沉积物固相-水相间频繁的物质交换，沉积物中所吸附的PAHs也会被沉积物中的底栖生物吸收，并通过食物链富集放大，进而大量富集于各种鱼类体内，最终危及到人类的健康并导致海洋生态平衡的毁坏。芴与萘在包括饮用水在内的国内外各种水体中被广泛检出，且国内水体中含量普遍高于国外。斑马鱼(Brachydaniorerio)的小规模饲养技术简单，遗传背景清楚明晰，与人类基因组同源性高，常年产卵，鱼卵透明易收集，仔鱼发育迅速，对有毒化合物敏感。1996年斑马鱼胚胎发育方式方法被经济合作与发展组织(OECD)制定为测定单一化学品毒性的标准方式方法之一。近年来，国内外开场逐步利用包括斑马鱼在内的鱼类胚胎，研究PAHs的致畸性和作用机理，但多集中于萘、菲、苯并［a］芘等常见2环、3环、5环PAHs，对芴的研究较少。本研究采用芴对斑马鱼成鱼及2个不同发育时期的斑马鱼胚胎进行染毒实验，研究其对斑马鱼的毒性效应，寻找芴对斑马鱼作用的最敏感时间与靶器官，旨在为进一步研究PAHs对鱼类不同发育阶段的毒性效应提供借鉴。1、材料与方式方法(Materialsandmethods)1．1实验动物产卵种鱼与急性毒性实验用鱼分批购买，分缸饲养，平均体长分别大于4．5cm与2．5cm。种鱼于产卵前驯化3个月以上，实验用鱼驯化1个月以上。两缸饲养用水均为曝气自来水，溶解氧为(9．100．08)mgL-1，水温保持为(261)℃，pH控制在8左右，光照/黑暗周期控制为14h∶10h。天天投喂经消毒处理的冷冻红虫饲料2次。1．2试剂芴(99．5%)购自天津光复精细化工研究所，丙酮(99．5%)购自天津江天统一科技有限公司。芴难溶于水，故需要选用助溶剂助溶。Hallare等通过实验比照乙醇、二甲基亚砜、丙酮等助溶剂，证明丙酮对斑马鱼影响最小。本实验选用丙酮作为助溶剂，且通过实验发现当丙酮浓度小于0．5%(质量分数)时，斑马鱼成鱼与胚胎发育不受影响。本实验最大助溶剂浓度不超过0．5%(质量分数)。1．3实验方式方法1．3．1成年斑马鱼染毒实验设计根据(危险化学品鱼类急性毒性分级试验方式方法〕(GB/T212812007)设计实验，以1000mL烧杯为受试用具，配制5组质量浓度间隔较大的溶液50、10、5、1、0．5mgL-1，并设置不加毒物的空白对照组进行预实验。根据预实验结果，在96h绝对致死浓度10mgL-1与96h最大耐受浓度1mgL-1间，按等对数间距配制5个浓度8．07、5．30、3．49、2．30、1．52mgL-1，同时设置未染毒空白对照。每个浓度放入10尾成年斑马鱼，每个浓度设置3组平行实验，以保鲜膜覆盖烧杯口，以免溶液挥发。采用静态置换法天天更新溶液的一半，以保证溶液浓度的稳定。更新溶液后，溶液中溶解氧浓度略有下降，稳定于(7．070．22)mgL-1。观察24h、48h、72h和96h的成鱼活动和中毒异常感觉和状态，拍照并记录各时间段鱼类死亡数。1．3．2斑马鱼胚胎染毒实验设计种鱼在早晨给光30min内完成交配，于倒置显微镜下选取发育正常鱼卵，用于毒性实验。共配制50、10、5、1、0．5、0．1mgL-1共6组浓度的芴水溶液对鱼卵进行预染毒实验，根据预实验结果选取5个浓度(10、8、5、2、1mgL-1)进行正式实验。根据Schulte等的研究方式方法设计实验，选用24孔细胞培养板作为鱼卵受试器具，每块细胞培养板为1个浓度，每孔容积3mL，实验时每孔参加2mL试剂，并置入1枚发育正常的鱼卵。24孔中，前20孔为同一浓度，后4孔为空白对照。将每块细胞培养板用保鲜膜封好，并放入事先设置好的温度为(281)℃，光暗比为14h∶10h的光照培养箱中。考虑受试试剂对斑马鱼胚胎毒性作用时间的差异，鱼卵实验共进行2组，浓度一样，分别为0hpf(hourspastfertilization)染毒组与10hpf染毒组。10hpf染毒组实验鱼卵于普通饲养用水正常发育10h，之后将其置于细胞培养板中进行染毒实验。在倒置显微镜下观察0hpf组鱼卵4h的卵凝结情况，之后与10hpf组实验鱼卵一起观察12h、24h、36h、48h、72h时的发育变化与毒理学终点，并统计各实验组的斑马鱼胚胎的死亡数与死亡方式、孵化数以及各项毒理学指标。1．4数据处理计算得出各浓度下成鱼的死亡率和鱼卵出现的不同毒理学终点的概率，通过PASWSTATISTICS18根据概率单位法计算成鱼的半致死浓度(LC50)、胚胎各毒理学终点的半致死浓度(LC50)和半效应浓度(EC50)，并统计36h各染毒组鱼卵胚胎心跳次数，根据单因素方差分析(ANOVA)比拟暴露组与对照组间的显著性差异，p＜0．05被以为差异显著，p＜0．01被以为差异极显著。2、结果(Results)2．1芴对斑马鱼成鱼的半数致死浓度在染毒实验中，斑马鱼随染毒浓度不同出现不同程度中毒异常感觉和状态:初入不同浓度的染毒溶液，斑马鱼均潜入水底，且活动延迟缓慢，呈现麻木状态，且当对烧杯壁进行敲打时，斑马鱼反响速度明显变得迟钝。随染毒时间的增加，较低浓度组(1．52、2．30mgL-1)成鱼逐步恢复活力，基本能够正常游动，而高浓度组(5．30、8．07mgL-1)成鱼的呼吸变得极为急促，失去水中平衡能力，出现侧翻侧泳现象，部分鱼类在水中呈现与地面垂直直立状，并逐步抽搐而死(见图1a)。死亡鱼体鳃部及心脏部明显红肿，且鱼体脱色严重，几近白色，高浓度组(8．07mgL-1)鱼体脊椎反向弯曲严重(见图1b)。成鱼各时间段LC50见表1，LC50值随染毒时间增加，缓慢降低，表示清楚96h内暴露时间越长，芴的毒性愈明显，这讲明芴对生物体的毒性大小受暴露时间影响。芴对成年斑马鱼的96h-LC50约为3．6mgL-1。根据GB/T212812007的标准，芴对成年斑马鱼的96h-LC50在1～10mgL-1之间，其毒性为急性Ⅱ类标准。2．2芴对不同染毒时间的斑马鱼胚胎半数致死浓度的比拟斑马鱼胚胎前12h主要死亡方式为卵凝结(图1d)，在12h后部分胚胎出现发育阻滞，之后停止发育，胚胎随时间推移逐步变得模糊不清，最终溃烂解体。0hpf与10hpf这2组的LC50结果见表2，能够看出0hpf组各LC50值中，4h-LC50最高，到达17．08mgL-1，72h-LC50最低，为5．88mgL-1。其余各时间段LC50值随染毒时间增加而降低，且在4h到12h之间有一个较大的下降经过，之后逐步趋于稳定。这表示清楚随着染毒时间的增加，斑马鱼胚胎对芴的致死敏感性逐步减小，在前12h芴对斑马鱼胚胎死亡率变化影响较大，12h后死亡率趋于稳定。10hpf组由于在受精后10h开场染毒，该组在12h(染毒后2h)观察时并无鱼卵死亡，故12h时间点无值，估计此点LC50值远大于24h的28．89mgL-1。此组实验，除高浓度组(8、10mgL-1)在24h出现少数死亡鱼卵，之后各浓度组并无鱼卵继续死亡，故24h、48h、72h这3个时间点LC50相等，均为28．89mgL-1。2．3芴对不同染毒时间的斑马鱼胚胎半数效应浓度的比拟本实验中0hpf与10hpf这2组观察到的针对斑马鱼胚胎的非致死类指标包括:24h发育阻滞(图1f)、24h无主动运动、36h心率异常、48h心包囊肿(图1g)、48h卵黄囊水肿，72h心包囊肿(图1h)，72h脊柱弯曲(图1i)等。由于72h畸形这2项指标成个例出现，不具备统计学价值，故主要分析其余5项非致死类指标，各项指标发生的半效应浓度(EC50)见图2。由图2能够看出，0hpf组36h心率异常为斑马鱼胚胎最敏感的指标，其EC50为2．15mgL-1，最不敏感指标为24h发育阻滞，其EC50为8．99mgL-1，0hpf组各指标敏感性依次为36h心率异常＞48h心包囊肿＞24h无主动运动＞48h卵黄囊水肿＞24h发育阻滞。10hpf组中，24h无主动运动、36h心率异常、48h心包囊肿三者EC50值较为接近，分别为6．61、7．64、6．41mgL-1，3项指标的值均远低于24h发育阻滞，这表示清楚它们对芴的非致死效应敏感性均远高于24h发育阻滞。10hpf组的5项指标的EC50值均在不同程度上高于0hpf组的所对应指标的EC50值，这是由于10hpf组染毒时间短，毒性蓄积量较小，进而EC50值较高。但10hpf组相对于0hpf组，各指标EC50的增量并不呈比例关系，这一点还有待进一步分析。2．4芴对斑马鱼胚胎心率的影响各浓度下0hpf和10hpf组的36h胚胎心率见图3和图4。从这2个图可知，相对于对照组，斑马鱼胚胎的心率经不同浓度的芴水溶液染毒后均遭到一定程度的抑制，且抑制率随浓度增大而增大。华而不实，0hpf斑马鱼胚胎的各染毒组，1mgL-1与2mgL-1这2个低浓度组与对照组无显著性差异，5、8、10mgL-1这3组与对照组差异极显著(p＜0．01)，相对于对照组的抑制率分别到达30．1%、41．3%、35．8%，0hpf斑马鱼胚胎的8mgL-1染毒组中，心率抑制率达峰值，继续增加浓度不会导致心率抑制率增加。同时8mgL-1组标准偏差值最大，这是由于斑马鱼个体存在差异，对芴毒性的抵抗性不同，因而心率被抑制的程度也有所不同。10hpf斑马鱼胚胎的各染毒组中，1、2、5mgL-1这3组与对照组相比，心率均无显著性差异，但1mgL-1组出现部分心率大于对照组的胚胎，这是由于较低含量的芴在胚胎体内蓄积，引起了斑马鱼胚胎心率的应激反响。8mgL-1组与10mgL-1组与对照组相比，存在显著性差异(p＜0．05)，心率抑制率到达12．6%和20．6%。芴对10hpf组的心率影响小于对0hpf组的心率影响，这可能是由于10hpf组染毒时间较短，胚胎体内芴的蓄积量要小于0hpf组的缘故。3、讨论(Discussion)有机污染物毒性作用可分为麻醉型毒性和反响型毒性2种。几乎所有有机物对生物都表现出基本的致麻醉作用，这种麻醉作用一般被称为基本毒性。麻醉毒性一般又分为非极性麻醉和极性麻醉2种。非极性麻醉型化合物能够穿透细胞膜，并毁坏细胞膜的功能，进而从内部影响细胞的正常运行。而极性麻醉型化合物通常为分子构造中具有强失电子的氨基、羟基的芳烃化合物，其毒性一般高于基本毒性。在本研究中，成年斑马鱼在不同浓度的芴溶液中均呈现麻木状态，分析芴的分子构造，为介于2环与3环间的多环芳烃，并不包含氨基、羟基等强失电子构造的基团，因而揣测芴对斑马鱼成鱼的主要毒性机理为非极性麻醉。这也与Inacardona等揣测的结果相符合，他对3环PAHs菲进行深切进入研究，发现其机制是在生物膜内大量蓄积的化合物毁坏了细胞双层脂膜的功能，并进而导致心脏功能的紊乱，其毒性属于非极性麻醉效应。这也讲明介于2环与3环间的PAHs芴与3环PAHs菲的毒性类似。Charles等将斑马鱼胚胎的发育定义为7个阶段:合子、卵裂、囊胚、原肠、分节、咽囊以及孵化期。分别对应的胚胎发育时间为0h、0．75h、2．25h、5．25h、10h、24h、48h。通过比照0hpf组与10hpf组胚胎LC50变化的差异，发现经过一样时间的染毒，LC50变化比例并不一样，这表示清楚斑马鱼胚胎发育不同阶段对芴的致死敏感性并不一样。同时0hpf组各时间点的LC50远小于10hpf组，这也讲明0hpf组鱼卵对芴的致死敏感性远大于10hpf组，因而推断芴对斑马鱼胚胎的毒性效应主要发生在胚胎受精后的前10h，即分节期之前。成鱼、0hpf组、10hpf组斑马鱼的48h-LC50分别为4．013、6．074、28．980mgL-1。能够看出三者对芴致死性效应的敏感性为成鱼＞斑马鱼胚胎0hpf染毒＞斑马鱼胚胎10hpf染毒。这可能是由于相较于成年斑马鱼，斑马鱼胚胎存在卵膜，其在斑马鱼体外又构成了一层屏障。故斑马鱼成鱼比斑马鱼胚胎对芴的直接染毒更为敏感。而且胚胎卵膜本身也随发育时间的增加，变得能够抵御水体中较大浓度的芴，这可以以解释分节期前的斑马鱼胚胎对芴的致死性效应具有更高层次的敏感性，而分节期后斑马鱼胚胎具有更大的耐受性。分析斑马鱼胚胎出现的各毒理学终点，0hpf组在染毒4h后，部分胚胎出现卵凝结现