脊灰病毒空心颗粒、实心颗粒的分离技术探究,微生物论文

脊灰病毒空心颗粒、实心颗粒的分离技术探究,微生物论文摘要：目的比拟3种不同密度梯度离心方式方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。方式方法选择蔗糖密度梯度离心、氯化铯密度梯度离心、Optiprep(碘克沙醇溶液)密度梯度离心方式方法,对脊髓灰质炎病毒进行纯化,抽取离心之后的蛋白条带,通过计算蛋白回收率、SDS分析、病毒颗粒透射电镜观察,评价其对病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。结果病毒液经蔗糖、氯化铯和Optiprep3种介质超速离心,均能分离空心颗粒和实心颗粒。氯化铯密度梯度离心法蛋白回收率优于Optiprep及蔗糖密度梯度离心法；Optiprep密度梯度离心法蛋白纯度优于氯化铯及蔗糖密度梯度离心法。结论通过蛋白回收率、SDS分析、病毒颗粒透射电镜观察初步评价了3种方式方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒和实心颗粒的分离效果,为脊髓灰质炎病毒分离纯化提供了参考。本文关键词语：氯化铯;蔗糖;碘克沙醇;密度梯度离心;空心颗粒;实心颗粒;纯化;Abstract：ObjectiveTocomparetheseparationeffectsofemptyandsolidviralparticlesofpoliovirusbysucrosedensitygradientcentrifugation,cesiumchloridedensitygradientcentrifugationandOptiprepdensitygradientcentrifugation.MethodsPolioviruswaspurifiedbythreekindsofdensitygradientcentrifugationmethodsrespectively,andtheproteinbandswereextracted.Theseparationeffectsofemptyandsolidviralparticleswereevaluatedbyproteinrecoveryrate,SDSandtransmissionelectronmicroscopy.ResultsBothemptyandsolidviralparticleswereseparatedbyultracentrifugationinthreemedia.TheproteinrecoveryrateofcesiumchloridecentrifugationwashigherthanthoseofOptiprepandsucrosedensitygradientcentrifugation.However,thepurityofproteinpurifiedbyOptiprepcentrifugationwashigherthanthosebycesiumchlorideandsucrosedensitygradientcentrifugations.ConclusionTheseparationeffectsofemptyandsolidviralparticlesbythreedensitygradientcentrifugationswerepreliminarilyevaluated,whichprovidedareferencefortheseparationandpurificationofpoliovirus.Keyword：Cesiumchloride;Sucrose;Optipprep;Densitygradientcentrifugation;Emptyparticles;Solidparticles;Purification;在病毒研究经过中，病毒纯化方式方法一直是研究经过的难点，最常用的方式方法一般为密度梯度离心法[1,2]。区带离心又分为差速区带离心和平衡区带离心。两种区带离心法均需先在离心管中用某种低分子溶质〔如蔗糖溶液〕调配好密度梯度，在密度梯度之上参加待处理的料液后进行离心操作。区带离心是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下将颗粒分配至梯度中某些特定位置上，构成不同区带的分离方式方法。该方式方法优点为：(1)分离效果好，可一次获得较纯颗粒；(2)适应范围广，可同差速离心法一样分离沉降系数差的颗粒，又可分离具有一定浮力密度差的颗粒；(3)颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已构成的区带由于对流而引起混合。其最常用的介质为氯化铯、蔗糖和多聚糖，在流感病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎〔简称脊灰〕病毒以及EV71等肠道病毒的分离中应用比拟广泛[3,4,5,6,7,8]。但也有文献报道，使用Optiprep〔碘克沙醇溶液〕分离效果好[9]。脊灰病毒属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属[10]。病毒颗粒核衣壳为立体对称的二十面体，无包膜，有60个壳微粒，病毒中心由单股RNA组成，外围由60个壳粒拷贝组成，壳粒中含4种构造蛋白，分别为VP1、VP3和由VP0分裂而成的VP2和VP4。VP1为主要的外露蛋白，至少含2个表位，可诱导中和抗体产生[11]。因而，蛋白进行电泳时，实心颗粒会出现VP1、VP2、VP3、VP4这4种构造蛋白，但VP4一般含量较少，不易出现。而空心颗粒会出现VP0、VP1、VP3这3种构造蛋白[12]。因而，脊灰疫苗在生产经过中进行质量控制的关键是进行D抗原〔实心颗粒〕含量的检测[13]。当前国内外绝大部分生产商采用ELISA法检测脊灰D抗原[14]。一般是基于单抗、多抗的单用或两者的联用。理想的检测抗体应该是能够特异性辨别脊灰D抗原而不辨别C抗原〔空心颗粒〕的抗体。因而，在挑选经过中必须使用尽可能纯化的D抗原及C抗原。基于此，本研究初步比拟了蔗糖密度梯度离心、氯化铯密度梯度离心、Optiprep密度梯度离心3种方式方法对脊灰病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。1、材料与方式方法1.1、病毒脊灰Sabin株Ⅰ型病毒原液〔蛋白含量为4.52mg/mL〕由武汉生物制品研究所有限责任公司肠道疫苗室提供。1.2、主要试剂及仪器Optiprep(60%〕购自美国Sigma公司；蔗糖购自国药集团化学试剂有限公司；氯化铯购自生工生物工程〔上海〕股份有限公司；PierceBCA定量分析试剂盒、蛋白质marker购自美国ThermoFisher公司；蛋白电泳仪购自美国BioRad公司；超离管购自美国Beckman公司；超滤离心管购自美国Millipore公司。1.3、氯化铯密度梯度离心配制密度为1.34g/cm3的氯化铯溶液，将华而不实1份用PBS定容至13.5mL，另外1份参加已超滤浓缩的病毒液3.5mL〔总蛋白含量为15.82mg),PBS定容至13.5mL，加至超离管中，热封，4℃，680000g离心18h；暗室抽取蛋白条带，加至超滤离心管中，参加PBS至超滤管管口处，4℃，3000g离心10min；待超滤管中液体减少至1.5mL后，重复该经过5次，最后1次离心结束后，收集超滤离心管中的溶液。1.4、蔗糖密度梯度离心配制成梯度为15%、25%、35%、45%、55%的蔗糖溶液，依次从低浓度到高浓度铺蔗糖密度梯度。在顶端液面上参加3.5mL浓缩病毒液〔总蛋白含量为15.82mg),480000g离心3.5h；暗室抽取蛋白条带，加至超滤离心管中，PBS稀释，4℃，3000g离心10min；重复该经过5次，最后1次离心结束后，收集超滤离心管中的溶液。1.5、Optiprep密度梯度离心从低到高配制成梯度为15%、25%、35%、45%、55%的Optiprep溶液。在顶端液面上参加3.5mL浓缩病毒液〔总蛋白含量为15.82mg),4℃，480000g离心3.5h；暗室抽取蛋白条带，加至超滤离心管中，PBS稀释，4℃，3000g离心10min；重复该经过5次，最后1次离心结束后，收集超滤离心管中的溶液。1.6、蛋白含量检测采用BCA法。标准品蛋白浓度设为1、2.5、5、10、20、40、200g/mL，绘制标准曲线。详细操作按PierceBCA定量分析试剂盒讲明书进行。1.7、纯度分析采用12%SDS分析。参加4SDS复原型上样缓冲液，混匀，100℃煮10min；上样，非预染蛋白质marker10L/孔，样品20L/孔，120V恒压电泳；恒温染色3h；脱色至背景干净。利用QuantityOne软件分析结果。1.8、病毒颗粒的透射电镜观察将样品稀释至10～20g/mL，取1滴于薄膜手套上，将铜网正面置于华而不实5min；取出铜网，待自然枯燥后，将铜网正面置于磷钼酸液滴中5min；取出铜网，自然晾干，送中国科学院武汉病毒研究所进行透射电镜分析。2、结果2.1、超速离心分离条带的观察结果显示，病毒液经3种介质超速离心分离条带后，离心管里均可见3条条带，华而不实氯化铯和Optiprep的条带较浓，蔗糖的条带略微弥散，见图1。2.2、3种方式方法纯化后的蛋白回收率获得的标准曲线方程为y=0.0124x-0.0108，蛋白浓度与对应的A562具有良好的线性关系，R2=0.9997，见图2。氯化铯、Optiprep及蔗糖密度梯度离心法蛋白回收率分别为79.9%、62.5%和52.3%，见表1。2.3、3种方式方法纯化后的蛋白纯度12%SDS分析显示，Optiprep、氯化铯及蔗糖密度梯度离心法纯化后的蛋白纯度分别为97.27%、95.75%和93.27%，见图3。图1病毒液经3种介质超速离心分离条带Fig1.Separationofpoliovirusparticlesbyultracentrifu-gationinthreemediaA：蔗糖；B：氯化铯；C:Optiprep。图2BCA法检测蛋白含量标准曲线Fig2.StandardcurvefordeterminationofproteincontentbyBCA表1病毒液经3种方式方法纯化后蛋白含量及回收率的比拟2.4、病毒液的透射电镜观察选择Optiprep密度梯度离心法分离的上、中、下层病毒液进行透射电镜观察，结果显示，上层、中层为不完好的病毒颗粒，即空心颗粒，下层为完好的病毒颗粒，即实心颗粒，且病毒颗粒纯度较高，见图4。图33种介质纯化后蛋白的SDS分析Fig3.SDSprofileofproteinpurifiedbyultracentri-fugationinthreemediaM：预染低分子量蛋白质marker;1～3：依次为氯化铯分离后的上、中、下三层条带；4～6：依次为Optiprep分离后的上、中、下三层条带；7～9：依次为蔗糖分离后的上、中、下三层条带。图4Optipre分离后的空心颗粒〔A〕及实心颗粒〔B〕的透射电镜观察Fig4.Electronmicroscopyofempty(A)andsolid(B)viralparticlesafterOptipredensitygradientcentrifugation3、讨论本实验目的在于分离出纯度尽可能高的空心病毒颗粒，作为挑选抗脊灰I型病毒D抗原单克隆抗体中的实验材料。基于此，在动物免疫经过中需要大量的免疫原时，后续试验可选用氯化铯作为密度梯度离心的介质；而对于单克隆抗体挑选用的抗原时，则选用Optiprep作为密度梯度离心的介质。密度梯度离心方式方法中，当前最常用的介质仍然是氯化铯、蔗糖等。这两种介质在病毒纯化经过中能知足绝大多数的需求。但根据纯化病毒的目的不同，应选择不同的介质。假如想获得大量的分离后的病毒颗粒时，最好选用氯化铯密度梯度离心法进行分离纯化，该方式方法能保证病毒蛋白的回收率；假如想尽可能分离出纯度更高层次的空心颗粒及实心颗粒时，最好选用Optiprep密度梯度离心法；假如对这两点要求均不高，则能够选择蔗糖密度梯度离心法，因蔗糖成本低，易获取。总之，这3种方式方法各有各的优点，能够根据目的不同选择不同的介质。以下为参考文献[1]LEEKC,LIMD,WONGSM,etal.Purification,crystallizationandX-rayanalysisofhibiscuschlorot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