研究生基本实验技能培训

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基本试验技能培训

首都医科高校附属北京朝阳医院基础医学探讨中心·梁燕85231624,liangyan1990@shou

主要内容1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作留意事项2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作留意事项3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作留意事项1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作留意事项1.1基因组DNA提取原理既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分别，又要保持DNA分子的完整。仪器准备：台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架试剂准备：试剂盒、无水乙醇等1.2基因组DNA提取试剂盒试剂盒内容操作步骤（重点）向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇，并标记；向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇，并标记；取200ul全血，加入20ul的蛋白酶K溶液，混匀；加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将吸附柱CB3放入收集管中准备好，将上述溶液移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；假如步骤5的溶液不能一次加完，可以再次重复步骤6；向吸附柱中加500ul的缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；操作步骤（重点）7.向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；将吸附柱和收集管再次离心，12000rpm离心2分钟，将吸附柱至于室温放置数分钟；将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；测OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓度。计算公式：OD260/OD280=1.7-1.9DNA浓度(ug/ul)=OD260×50×稀释倍数/1000OD260=0.1稀释倍数=250DNA浓度=0.1×50×250/1000=1.25ug/ul操作留意事项避开样品反复冻融56℃水浴摇匀可消退GB中的沉淀运用台式离心机，室温离心2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作留意事项仪器准备：PCR仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架试剂准备：ddH2O,PCRBuffer，dNTP，引物，PCR聚合酶，DNA模板2.1PCR体系和循环条件（重点）BclIPCRTotalvolume25ul*2ddH2O16.5ul33ul10×Buffer

2.5ul5uldNTP(25mM)2ul4ulPrimerF(10mM)1ul2ulPrimerR(10mM)1ul2ulExTaq(1U/ul)1ul2ulSum24ul48ul48/2=24ulTemplateDNA（0.1ug/ul)1ul1ul60℃，30s72℃，30s95℃，30s95℃，30s（预变性）72℃，30s（后延长）30cycles2.2PCR操作步骤（重点）计算好所需扩增的PCR体系；打开PCR仪预热，设置PCR循环条件；准备试剂，溶化，离心，置于冰上，备用；按依次加样，混匀，离心，分装；加入模板DNA，混匀，离心；放入PCR仪，Start。2.3PCR操作留意事项避开试剂反复冻融计算总量，依次加样更换吸头，避开污染3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作留意事项3.1琼脂糖凝胶电泳原理DNA分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；其移动速度与线性DNA片段长度成反比。配置1%的胶：称1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入100ml的1*TAE，微波炉加热至完全溶化；待凝胶温度降至50-60度时，加入1ul的EB（10mg/ml)，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-60分钟；轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1*TAE，没过加样孔；依据1ul上样Buffer+5ul的DNA混合后，点样；每排留一个孔加DNAmarker；100V电泳30分钟，凝胶成像仪照相。3.2琼脂糖凝胶电泳方法（重点）3.3电泳操作留意事项带手套操作EB凝胶冷却时间至少30分钟凝胶完全溶化MII-3II-2II-1I-2I-10应用BclI/RFLP多态位点进行基因连锁分析374211163

小结1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作留意事项2.PCRPCR体系和