长春新碱的发酵培养

长春新碱的发酵培养摘要：长春新碱是从抗癌中药长春花叶中提出的二聚吲哚类生物碱，临床上用于治疗急性淋巴细胞、何杰金及非何杰金淋巴瘤的确有效果。但是在植物中提取困难，就采用发酵的方法大量合成。关键词：长春新碱；抗癌；内生菌；发酵♦八—・▲前言长春花为夹竹桃科植物的全草，具有较高的药用价值［1］。迄今已经分离出70余种生物碱，其中以长春新碱和长春碱最具有价值。长春新碱是重要的抗癌药物之一，尤其对白血病具有显著疗效，通过干扰癌细胞纺锤体形成，使细胞有丝分裂停止于中期，从而阻断癌细胞的扩散。其主要来源一直是从长春花植物中提取。但此种生物碱在长春花中含量低，而合成和半合成又比较困难，长春花的细胞组织培养虽已成功,但有效药用成分含量太低，成本高，生产难度大，也未能实现工业化生产［1］。真菌因其易于培养，方便控制，生长快，还可以通过育种手段和控制培养条件等措施大幅度提高其有效成分含量与组织化生产等特点，有着广阔的应用前景。1长春新碱的理化性质游离的长春新碱为片状结晶，极不稳定，因此常用其硫酸盐。其盐为白色或类白色的结晶粉末，无臭，有吸湿性，遇光或热易变黄，熔点为218~220度，在水中易溶解，在甲醇或氯仿中能溶，在乙醇中微溶。2长春新碱的药理研究在细胞周期S期，VCR与微管蛋白结合，从而使中期细胞分裂停止，导致有丝分裂中的细胞群体明显增加，使细胞分裂停止于M期，因此是M期细胞周期特异性药物。长春新碱在明显抑制人慢性骨髓性白血病K562细胞增殖的同时显著降低细胞膜磷脂酰肌醇激酶的活性，提示降低PIK活性是其影响细胞核酸或蛋白质代谢，进而抑制细胞增殖的早期生化过程之一。急性淋巴细胞白血病(All)采用VCR体外骨髓净化与自体骨髓移植结合治疗ALL是目前最新的方法。施红等［3］发现长春新碱和甲基泼尼龙联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞系和淋巴瘤细胞系细胞的净化效果比单用VCR效果显著。胃癌长春新碱对胃癌的抑制率较高，且其抑制率有随药物浓度增加、作用时间延长而增高的趋势［4］。肝癌汤为学等观察在体外顺铂、5-Fu、长春新碱3种抗癌药物单用或者合用对人肝癌细胞株的相互作用。3种药物单独应用及两药合用时随着药物剂量增加效应也增加，两药大剂量合用时产生拮抗作用，小剂量合用时可产生协同作用，且效应大小与两药浓度比例及给药时间次序有关。这就可通过联合用药来降低VCR用量而达到高效。卵巢癌长春新碱是新进用于卵巢癌的化疗药物，但研究表明卵巢癌对VCR产生较高水平的耐药，以往的临床资料也显示VCR对卵巢癌的临床缓解率仅为14%左右[5].长春新碱在植物体内含量极低，仅为百万分之几，分离提取困难，且植物生长缓慢，资源短缺，故限制了该药的进一步开发利用。因此，寻找长春新碱的药源，已成为摆在人类面前的一项重大的研究课题。近年来国内外学者主要从3个方面来探索这类课题，即化学合成法、植物细胞及组织培养法和微生物发酵法。目前人们普遍认为微生物发酵法是一种最具潜力的方法。由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重要影响，甚至会产生和其寄主相同或相似的生理活性成分[6],而且，真菌易于培养，可以通过育种手段和控制培养条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量，并便于组织工业化生产。故利用微生物生产抗癌成分的对比为以后筛选真菌来生产药物奠定基础。3材料和方法材料:新鲜长春花3.2培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏培养基、改良的MM培养基。3.3内生真菌的分离：按常规无菌操作。取长春花不同部位的叶和茎干，按下列程序表面消毒：自来水冲洗f75%酒精漂洗（3-5min）f无菌水冲洗3-4次f0.1%升汞漂洗（10-30s）f无菌水冲洗5次。将上述处理过的叶片和茎在超净台条件下切割成约0.5cmX0・5cm的小片（茎取韧皮部），然后将小片种植于PDA平板上，置28度温箱培养3-7d后，即可见样品切割过的边缘有菌丝长出，经纯化后转接到PDA斜面上备用。为检查表面消毒是否彻底，可做对照试验，将上述同样处理过的茎叶不做切割，直接种植于PDA平皿上，置于相同的条件下培养，结果对照的茎段周围物任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是韧皮部内部的，不是表面的附生菌。3.4内生真菌的液体培养液体培养基为基本培养基（MM）,将1000ml培养液分装在250ml的三角瓶中。用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于27度摇床（100r/min）培养3-4d,待菌丝体长好后进行提取。3.5提取方法：发酵液1000mlf碱化（PH大于8）f离心（2500r/min）f沉淀f加CHCLf浓缩f置青霉3素小瓶中备用。3.6检测方法TCL检测硅胶板。展开剂；苯：丙酮=8:2；显色采用碘显色。液相色谱分析微生物产生与植物一致的次生代谢产物的可能性分析：生物在次生代谢过程中其生化途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中，其基本的生化过程信息有时还会传递到其它生物中去，在生物早期的系统发育过程中，一些具有完全互补的遗传特性或参与代谢过程的其它生物体（如细菌或蓝藻），被认为可以组合进真核细胞并发育成线粒体和叶绿体［7］。参考文献中国科学院植物研究所编.中国高等植物图鉴.北京:科学出版社,1985:430.郑珍贵,刘涤,胡之壁.长春花细胞大规模培养生产生物碱的研究现状.国外医药,植物药分册.1966,11(5):204-208.施红,严文伟.长春新碱联合甲基泼尼龙体外净化淋巴细胞白血病细胞的实验研究.中华血液学杂志,1994,15(10):526.艾军,何兰欣,梁索源,等.抗癌药物对体外胃癌细胞生长的抑作用.河北医科大学学报,2002,