chp细胞生长的学习课件

chp细胞生长的学习课件第1页/共51页第一节细胞生长调节因子的概述

一、细胞生长调节因子的概念细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。细胞生长因子常称为生长因子，实际上应包括负性细胞生长因子，即细胞生长抑制因子，因此以细胞生长调节因子来表达广义的细胞生长因子。

第2页/共51页二、细胞因子的共同特性共同的特征：1、绝大多数细胞因子是低分子量（15～30kD）的蛋白或糖蛋白。

2、细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。

3、一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子第3页/共51页三细胞因子的分类和生物学活性细胞因子的种类细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子六类。白细胞介素（IL）最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子，后来发现白细胞介素可由其他细胞产生，也可作用于其他细胞。第4页/共51页

干扰素（IFN）是最先发现的细胞因子，因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称干扰素。根据来源和理化性质，可将干扰素分为α、β和γ三种类型。IFN-α／β主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，也称为Ⅰ型干扰素。IFN-γ主要由活化T细胞和NK细胞产生，也称为Ⅱ型干扰素。肿瘤坏死因子（TNF）一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。肿瘤坏死因子分为TNF-α和TNF-β两种，前者主要由活化的单核-巨噬细胞产生，抗原刺激的T细胞、活化的NK细胞和肥大细胞也分泌TNF-α。TNF-β主要由活化的T细胞产生，又称淋巴毒素。第5页/共51页

集落刺激因子（CSF）是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化，并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。生长因子（GF）是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。多种未以生长因子命名的细胞因子也具有刺激细胞生长的作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子，如IL-2是T细胞的生长因子，TNF是成纤维细胞的生长因子。有些生长因子在一定条件下也可表现对免疫应答的抑制活性，如TGFβ可抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的成熟及巨噬细胞的激活。

第6页/共51页趋化性细胞因子是一个蛋白质家族，由十余种结构有较大同源性、分子量多为8～10kD的蛋白组成。趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。淋巴细胞趋化蛋白，对淋巴细胞有趋化作用。第7页/共51页二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定（－）一般制备方法细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低，主要是通过组织培养获得。动物细胞培养

1、基本概念体外培养就是将活的生物体结构成分或者活的微小个体放到体外环境中让共生存和生长的技术。

部分培养所培养的生物成分无外乎有两种结构形式，其一是小块组织或称为组织块，其二是将生物组织分散后制成的单个细胞。体外培养分为原代培养和继代培养两大类。第8页/共51页体外培养可分为植块培养法和分离（散）细胞培养法两大类方法。前者就是将植块直接进行培养，使之在体外条件下存活和生长；而后者就是将细胞悬液用于培养，使分散的细胞在体外条件下存活和生长。体外培养的结果无外乎有两种，一是维持生存，一是发生显著增长。第9页/共51页动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，而且已不是靠一个细胞包办一切生理活动，各种细胞都有明确的分工。为了适应其功能的需要，细胞的形态也有了相应的变化，我们称这种变化为分化（或称特化）。我们通常将离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型和贴壁非依赖型，前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。第10页/共51页2）生理特点①细胞的分裂周期长②细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象③正常二倍体细胞的生长寿命是有限的④动物细胞对周围环境十分敏感⑤动物细胞对培养基的要求高第11页/共51页动物细胞培养基大致可以分成3类：天然培养基在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。合成培养基成分明确的化学试剂配制而成。单纯采用这种合成培养基，细胞常常仍不能很好地增殖，甚至细胞都不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量的动物血清，最常用的是添加5％～10%的小牛血清。在杂交瘤细胞的培养中，血清的要求更高，常需用10%～20％的胎牛血清。第12页/共51页无血清培养基⑥动物细胞蛋白修饰功能与细菌不同动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行。在游离核糖体上合成的蛋白质都用于细胞质基质内，而在与膜结合的核糖体上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，它们多数为糖蛋白。这些寡糖链，有的在内质网中加接，有的在高尔基体内加接。在内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖，蛋白质的糖基化与细胞的许多生理功能密切相关，如细胞识别、表面受体、胞内消化和外排分泌物等。原核生物由于缺少糙面内质网结构，因此无法对蛋白质迸行糖基化和其他一系列翻译后修饰。综观动物细胞的上述6点生理特点，不难想象，与采用原核细胞相比，采用动物细胞作为宿主细胞生产药品，有它不足的一面，如培养条件要求高、成本贵，产量低等；但也有它优越的一面，即它们多半是分泌在胞外的，收集纯化方便；得到了较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此更与天然的产品一致，更适于临床使用。第13页/共51页3、生产用动物细胞的要求（1）、什么样的细胞允许用以生产人用的药品。正常组织分离的原代细胞只要是二倍体细胞，二倍体细胞的寿命一般都不会超过50代。取消了对传代细胞使用的限制（2）、用于生产的动物细胞不外乎3类①原代细胞原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。第14页/共51页②二倍体细胞系原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。③转化细胞系这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。这种转化过程可以是自发的，即正常细胞在传代培养过程中，大部分细胞随着传代次数的增加，寿命逐渐终结，但其中有个别细胞可自发地转化而形成有无限生命力的细胞系。第15页/共51页此外，直接从动物的肿瘤组织中建立的细胞系也是转化的细胞。由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要第16页/共51页4、基因工程细胞的构建和筛选尽管上述的原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者都已被用于生产中，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。（1）、真核细胞基因表达载体的构建为了要将外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在一个高效表达载体内。目前一般使用的载体有两类：一类是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状病毒等。

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另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。（2）、基因载体的导人和高效表达工程细胞株的筛选载体构建后，如何导人动物细胞呢？目前的方法大致可分为4类：融合法化学法物理法病毒法细胞融合法DNA-磷酸钙沉淀法电穿孔法重组逆转录病毒介导法脂质体介导法DEAE一葡聚糖法显微注射法重组洲A病毒介导法原生质融合法染色体介导法基因枪法多瘤病毒样颗粒介导法微细胞介导法鬼影红细胞介导法第18页/共51页

外源基因导入动物细胞的效率是很低的，依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统，从上百万个细胞中筛选出已整合并表达外源基因的工程细胞。FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库和生产用细胞库。第19页/共51页5、动物细胞的培养条件（1）所有的与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。（2）必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免即使是极微量的有害离子的掺入。（3）保证有适量的氧气供应。（4）需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。（5）有良好的适于生存的外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等。（6）及时分种，保持合适的细胞密度。第20页/共51页6、动物细胞大规模培养的方法动物细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种类分为原代细胞培养和传代细胞培养。又可根据培养基的不同分为液体培养和固体培养。还可根据培养容器和方式的不同分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养等。但从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。第21页/共51页1、悬浮培养所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。2、贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贝占壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度。3、贴壁一悬浮培养，或称假悬浮培养（1）微载体培养（2）包埋和微囊培养第22页/共51页动物细胞生物反应器1、搅拌罐式生物反应器2、气升式生物反应器3、中空纤维式生物反应器4、透析袋或膜式生物反应器5、固定床或流化床生物反应器第23页/共51页

植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。植物细胞培养

一、基本概念1、植物组织和细胞培养①幼苗及较大植株的培养，即为“植物培养”；②从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做“愈伤组织培养”；植物无菌培养技术分如下几类：第24页/共51页③能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养”；④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为“器官培养”⑤未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则为“胚胎培养”。

悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。2、悬浮培养第25页/共51页3、细胞培养

分生组织培养又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括1～2个叶原基。4、分生组织培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。第26页/共51页5、外植体

外植体是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。6、器官形成

器官形成一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽和根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。第27页/共51页如果在培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为“胚胎形成”。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体”（或“不定胚”）。7、无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体”第28页/共51页8、突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体。由单细胞形成的无性系称为“单细胞无性系”；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单细胞变异体”。第29页/共51页9、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”，又称“连续培养”。但习惯上“连续培养”一词多用于不断加人新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。第30页/共51页

二、植物细胞的结构特征植物细胞由细胞壁和原生质体两部分组成。原生质体包括细胞质、细胞核和液泡。细胞质和细胞核组成原生质。后含物常存在于细胞质和液泡中。与动物细胞与微生物细胞相比，植物细胞有3个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）

第31页/共51页第32页/共51页通常要采用化学或机械的方法加以控制。

植物细胞培养的基本技术

－、植物材料的准备

用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。如果不是取自种子库，而是来自温室或生长在大田植物的种子、幼苗、器官、组织等，因此培养前必须对外植体进行严格的灭菌处理。

原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的试剂。灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。第33页/共51页二、培养基及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤”，其特点是营养成分的可调控性。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。第34页/共51页1、无机盐2、碳源植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此，人们经常使用碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所谓光自养培养物。第35页/共51页3、植物生长调节剂

植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。4、有机氮源

第36页/共51页5、维生素三、培养方法植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培养和单倍体细胞培养；按培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养。所谓固体培养系统实际上包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养。固体培养的特点是简便易行、所占空间小。但也有一些缺点：①外植体或其愈伤组织仅有一部分与培养基相接触，第37页/共51页该部位的营养物质可被迅速吸收，从而形成培养基中营养物质的浓度差，并进而导致愈伤组织生长的不平衡；②由于外植体的基部插人固体培养基中，因此该处呈现气体交换不畅的状态，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的有害物质；③在静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部或一侧射人，因而在愈伤组织细胞间出现了极化现象，结果导致细胞群体的不均匀状态。④固体培养物有时需要测定一些生理生化指标。常用的固化剂有琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。第38页/共51页

外植体在培养3周左右必须移换至新鲜培养基上，以保持培养物的继续正常生长。移换一次培养基称一次继代培养。一种外植体经过一定次数的继代培养，其培养物就可用于悬浮培养。由于外植体诱导形成的愈伤组织开始比较紧密坚实，所以需要经过较长时间的多次继代培养后，愈伤组织变得较为疏松时才能进行悬浮培养。液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。静止液体培养具有简便易行的特点，而且培养基还不会出现营养物质浓度差的现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，并不断振（转）动下进行培养。第39页/共51页1、成批培养法

将培养基一次性加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期，人们基于此原理设计了植物细胞的两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。2、半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。第40页/共51页3、连续培养法连续培养法是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。4、固定化培养法植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期，表明细胞成块而趋于分化时，细胞块中各个细胞处于一定理化梯度之下，此现象与完整植株类似，由此人们提出了植物细胞固定化培养技术。细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物。第41页/共51页细胞生长过程可归纳为：①生长细胞体积倍增，可制备同步化的细胞。②生长细胞复制DNA，也有蛋白质的含量变化。

制备中应特别注意以下几点：（1）生产中必须保证生产条件的一致性，以免影响质量。第42页/共51页（2）使用转化细胞系（特别是肿瘤原性细胞系）作为制备细胞因子的基质，应使用严格的纯化手段，以去除可能引起安全性问题的污染物。（3）在外来宿主中表达的天然的基因编码的细胞因子，其结构、生物学或免疫学性质可能与天然的细胞因子不同。（4）生长程序中可能带来有害的中间产物，如内毒素、表达产物中潜在的致癌性DNA。（5）制定生产规程应详尽介绍细胞系、添加物（如诱生剂）、增强对或其他物质（如抗生素）等的特性。第43页/共51页二、测定方法分离纯化后的细胞生长调节因子，常用放射免疫法直接测定，但其活性和细胞生物学作用机制方面的研究仍采用细胞培养测定活性。测定中注意以下几点：（1）必须根据因子的作用特性，掌握其生长需求条件，排除细胞代谢产物的影响，若出现生长抑制的现象，可增