发酵产物的提取与精制

关于发酵产物的提取与精制第1页，共118页，2023年，2月20日，星期三概论下游加工过程在发酵工程中的地位下游加工过程的定义发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程(Downstreamprocessing)。它由一些化学工程的单几操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。第2页，共118页，2023年，2月20日，星期三地位传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部份占整个工厂投资费用的60%。对重组DNA发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的80%~90%。第3页，共118页，2023年，2月20日，星期三下游加工过程的特点1、成分复杂：细胞、代谢产物、残余培养基2、产品浓度低：传统发酵一般1～10％3、失活问题4、不稳定性5、纯度和生物安全问题6、收率低：50％左右第4页，共118页，2023年，2月20日，星期三发酵工业下游技术的一般工艺过程下游加工过程由各种化工单元操作组成。由于生物产品品种多，性质各异，故用到的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作，理论比较成熟，而另一些则为新近发展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两者之间的有离子交换过程等。第5页，共118页，2023年，2月20日，星期三一般工艺过程一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离；初步纯化(提取)；高度纯化(精制)；成品加工。第6页，共118页，2023年，2月20日，星期三工艺过程的划分：预处理和固液分离：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。成品制作：成品形式由产品的最终用途决定。第7页，共118页，2023年，2月20日，星期三选择下游加工工艺的原则：是胞内产物还是胞外产物原料中产物和主要杂质浓度产物和主要杂质的物理化学特性及差异产品用途和质量标准产品的市场价格废液的处理方法等第8页，共118页，2023年，2月20日，星期三第一节发酵醪的预处理和菌体分离目的（1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。第9页，共118页，2023年，2月20日，星期三一、发酵液的预处理采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子。第10页，共118页，2023年，2月20日，星期三发酵醪预处理的要求:（1）菌体的分离（2）固体悬浮物的去除（3）蛋白质的去除（4）重金属离子的去除（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除（6）改变发酵醪的性质（7）调节适宜pH值和温度第11页，共118页，2023年，2月20日，星期三预处理的方法1，凝聚和絮凝技术2，杂蛋白质的去除3，高价无机离子的去除方法第12页，共118页，2023年，2月20日，星期三（一）凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝能有效改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。第13页，共118页，2023年，2月20日，星期三1、凝聚作用凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：Al2（SO4）318H2O（明矾）、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3：Al(OH)3、FeSO4、Ca(OH)2或石灰等。

第14页，共118页，2023年，2月20日，星期三2、絮凝作用絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。

常用的絮凝剂聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠第15页，共118页，2023年，2月20日，星期三第16页，共118页，2023年，2月20日，星期三絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量第17页，共118页，2023年，2月20日，星期三影响絮凝的因素絮凝剂的添加量发酵液的pH絮凝剂的分子量搅拌转速搅拌时间第18页，共118页，2023年，2月20日，星期三絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。第19页，共118页，2023年，2月20日，星期三发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。第20页，共118页，2023年，2月20日，星期三（二）杂蛋白质的去除方法1．等电点沉淀

蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。2．变性沉淀

使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag＋、Cu2＋、Pb2＋等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。3.加各种蛋白质沉淀剂加入某些化学试剂使蛋白质与之形成复合物沉淀4．吸附

在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。

预处理的方法第21页，共118页，2023年，2月20日，星期三3，高价无机离子的去除方法钙离子，可用草酸。镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。第22页，共118页，2023年，2月20日，星期三二、发酵液的固液分离微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。固液分离是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去第23页，共118页，2023年，2月20日，星期三（一）影响过滤速度的因素1、发酵液中粒子的直径2、发酵液黏度培养基的组成未用完培养基的数量消沫油发酵周期第24页，共118页，2023年，2月20日，星期三菌种对过滤速度影响真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。第25页，共118页，2023年，2月20日，星期三培养基的组成对过滤速度影响用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难；发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。第26页，共118页，2023年，2月20日，星期三发酵周期对过滤的影响正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。第27页，共118页，2023年，2月20日，星期三改善过滤性能的方法等电点蛋白质变性吸附凝聚和絮凝加入助滤剂直接在发酵液中形成填充-凝固剂酶解作用第28页，共118页，2023年，2月20日，星期三（二）固—液分离设备不同性状约发酵液应选择不同的固—液分离设备。常用于发酵液的分离设备有：板框压滤机真空鼓式过滤机离心分离机第29页，共118页，2023年，2月20日，星期三板框压滤机优点：板框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低，动力消耗少等优点。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。第30页，共118页，2023年，2月20日，星期三鼓式真空过滤机优点能连续操作，能实现自动化控制缺点压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。第31页，共118页，2023年，2月20日，星期三离心分离优点分离速度快，效率高，操作时卫生条件好等优点，适合于大规模的分离过程。缺点投资费用高，能耗较大。第32页，共118页，2023年，2月20日，星期三三、细胞的破碎与分离微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。第33页，共118页，2023年，2月20日，星期三第34页，共118页，2023年，2月20日，星期三4，微生物细胞的破碎技术机械方法高压匀浆器珠磨法撞击破碎法超声波破碎非机械方法酶解渗透压冲击冻结和融化干燥法化学法第35页，共118页，2023年，2月20日，星期三高压匀浆器采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂高压匀降的排出阀第36页，共118页，2023年，2月20日，星期三第37页，共118页，2023年，2月20日，星期三珠磨法研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。第38页，共118页，2023年，2月20日，星期三超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。第39页，共118页，2023年，2月20日，星期三撞击破碎法一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25˚C至-30˚C形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，该法对冷冻—融解敏感的生化物质不适用。第40页，共118页，2023年，2月20日，星期三渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。第41页，共118页，2023年，2月20日，星期三冻结-融化法将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。第42页，共118页，2023年，2月20日，星期三干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。第43页，共118页，2023年，2月20日，星期三

化学法用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。第44页，共118页，2023年，2月20日，星期三

酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。第45页，共118页，2023年，2月20日，星期三自溶作用是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。第46页，共118页，2023年，2月20日，星期三第47页，共118页，2023年，2月20日，星期三破碎方法的选择选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：细胞的数量；所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性；要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，尽可能采用最温和的方法；具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。第48页，共118页，2023年，2月20日，星期三第二节发酵产物的提取提取的目的是除去与目标产物理化性能有很大差异的物质，使产物浓缩，并明显提高产品的纯度，常用的方法有沉淀法、树脂法、吸附法、蒸馏法、萃取法、膜分离技术和凝胶层析法等等。第49页，共118页，2023年，2月20日，星期三一、沉淀法沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高和操作简单等优点，是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。第50页，共118页，2023年，2月20日，星期三根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：盐析法；等电点沉淀法；有机溶剂沉淀法；非离子型聚合物沉淀法；聚电解质沉淀法；高价金属离子沉淀法。第51页，共118页，2023年，2月20日，星期三（一）盐析法在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。盐析法成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。但是效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化。第52页，共118页，2023年，2月20日，星期三①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。盐析的机理第53页，共118页，2023年，2月20日，星期三盐析机理示意图第54页，共118页，2023年，2月20日，星期三第55页，共118页，2023年，2月20日，星期三第56页，共118页，2023年，2月20日，星期三2、影响蛋白质盐析效果的主要因素1）盐析剂的选择2）盐析剂的加入量3）温度和pH4）操作方式第57页，共118页，2023年，2月20日，星期三（二）等电点沉淀法两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础进行分离的方法既等电点沉淀法。利用等电点法沉淀蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整pH值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。第58页，共118页，2023年，2月20日，星期三（三）有机溶剂沉淀法利用蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称有机溶剂沉淀法。有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，导致蛋白质相互聚集沉淀析出。第59页，共118页，2023年，2月20日，星期三有机溶剂沉淀法的优缺点该法优点在于：①分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；②沉淀不用脱盐，过滤较为容易；③在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。第60页，共118页，2023年，2月20日，星期三有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂的选择首要条件是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇,由于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用时必须谨慎温度低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；样品浓度和pH与盐析法中的作用基本相同；第61页，共118页，2023年，2月20日，星期三二、树脂法和吸附法树脂法和吸附法在生化物质的提取、浓缩、纯化、分离、脱盐、转化、中和及脱色等操作单元上有着广泛的应用（一）树脂法原理：利用树脂与产物结合，让产物保留在树脂上与杂质分开，再从树脂上洗脱产物第62页，共118页，2023年，2月20日，星期三离子交换树脂法离子交换作用：是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里溶液称流动相，而固体称固定相。蛋白质、氨基酸、核酸、酶、抗生素。第63页，共118页，2023年，2月20日，星期三该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，第64页，共118页，2023年，2月20日，星期三离子交换树脂的基本概念离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。阳离子型阴离子型第65页，共118页，2023年，2月20日，星期三2、树脂的选择及其操作方法要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析。取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。第66页，共118页，2023年，2月20日，星期三基本操作

缓冲液的选择层析柱的选择

洗脱流速↓↙加样洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定离子交换剂的清洗、再生和保存

↓↓↓←离子交换剂的处理

↘↑离子交换剂的选择

第67页，共118页，2023年，2月20日，星期三（二）吸附法在发酵工业的下游加工过程中，吸附法应用于发酵产品的除杂、脱色、有毒物质和抗生素的提纯精制。第68页，共118页，2023年，2月20日，星期三吸附法的原理吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用。第69页，共118页，2023年，2月20日，星期三吸附的目的将产品吸附浓缩于吸附剂上；将杂质、色素等需要从发酵液中去除的物质吸附于吸附剂上。第70页，共118页，2023年，2月20日，星期三吸附法的优缺点优点：可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。缺点：吸附法选择性差、收率不高。无机吸附剂性能不稳定，不能连续操作，劳动强度大。炭粉等吸附剂影响环境卫生。凝胶类吸附剂、大网格聚合物吸附剂第71页，共118页，2023年，2月20日，星期三吸附的类型物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附。化学吸附：化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力范围。交换吸附：吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。第72页，共118页，2023年，2月20日，星期三第73页，共118页，2023年，2月20日，星期三吸附剂的基本要求吸附剂要求颗粒密度小，表面积大，但孔隙也不能太多，否则被吸附物质不易被洗脱。吸附剂的颗粒大小要均匀。吸附剂的吸附能力要大，但不能影响洗脱。第74页，共118页，2023年，2月20日，星期三吸附剂的种类有机吸附剂（活性炭）无机吸附剂（硅胶、氧化铝）第75页，共118页，2023年，2月20日，星期三活性炭是使用较多的一种非极性吸附剂。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。目前，多用于在纯化过程中进行脱色和脱臭等操作中的简单吸附过程第76页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.硅胶

是最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110℃加热30min，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到500℃，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。第77页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.氧化铝

分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。氧化铝用前也需脱水活化，通常于400℃高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间，可得到Ⅰ级或Ⅱ级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。4.大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。第78页，共118页，2023年，2月20日，星期三三、萃取溶剂萃取法是20世纪40年代兴起的一项化工分离技术，它是用一种溶剂将产物自另一种溶剂(如水)中提取出来，达到浓缩和提纯的目的。溶剂萃取法比化学沉淀法分离程度高，比离子交换法选择性好，传质快，比蒸馏法能耗低且生产能力大，周期短，便于连续操作、容易实现自动化等。第79页，共118页，2023年，2月20日，星期三（一）萃取的基本概念1、萃取：利用物质在两种成相的溶剂中溶解度的不同，使所需的目的物质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中，从而达到分离纯化的目的。溶剂萃取法是以分配定律为基础的。在萃取中，被提取的溶液称为料液，其中欲提取的物质称为溶质。第80页，共118页，2023年，2月20日，星期三2、反萃取蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层,同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形,接着两界面形成含有蛋白质的反胶团,然后扩散到有机相中,从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件(如pH值、离子种类或离子强度),又可使蛋白质从有机相中返回到水相中,实现反萃取过程。第81页，共118页，2023年，2月20日，星期三3、物理萃取和化学萃取第82页，共118页，2023年，2月20日，星期三（二）乳化和破乳化乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系乳浊液的形式：水包油、油包水常用的去乳化的方法：过滤和离心、加热、稀释法、加电解质、吸附法、顶替法、转型法第83页，共118页，2023年，2月20日，星期三（三）常用去乳剂阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶）阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）第84页，共118页，2023年，2月20日，星期三（四）萃取方式混合器溶剂发酵液分离器提取液残余液第85页，共118页，2023年，2月20日，星期三多次提炼法混合器溶剂发酵液分离器提取液混合器溶剂分离器提取液混合器分离器提取液残余液溶剂残余液残余液第86页，共118页，2023年，2月20日，星期三多级对流萃取第一混合器分离器第二混合器分离器第三混合器分离器最后提取液提取液残余液残余液最后残余液提取液溶剂发酵液一级二级三级A90%A70%A50%第87页，共118页，2023年，2月20日，星期三四、蒸馏分离提取法蒸馏是分离液体混合物的一种有效方法常用的蒸馏方法：简单蒸馏、精馏和特殊精馏操作方式：间歇式、连续式压力：常压蒸馏、加压蒸馏、真空蒸馏第88页，共118页，2023年，2月20日，星期三酒精蒸馏选择蒸馏流程依据：1）生产原料和成熟醪特性、2）产品质量的实际要求3）节约蒸汽4）节约用水第89页，共118页，2023年，2月20日，星期三五、凝胶层析常出现多种名称：如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。凝胶层析的定义：

凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。第90页，共118页，2023年，2月20日，星期三凝胶层析的应用范围：

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的优点

凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。第91页，共118页，2023年，2月20日，星期三凝胶层析的基本原理

凝胶层析的原理

l分子大小不同混合物上柱；2洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3大小分子分开：4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中第92页，共118页，2023年，2月20日，星期三

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另

第93页，共118页，2023年，2月20日，星期三一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。Vt=Vo+Vi+VgVt=πR2h第94页，共118页，2023年，2月20日，星期三

V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。

Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即

Ve＝Vo＋Vi第95页，共118页，2023年，2月20日，星期三

层析柱

（a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）

第96页，共118页，2023年，2月20日，星期三

层析系统连接示意图

1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器；

7.核酸一蛋白质检测仪第97页，共118页，2023年，2月20日，星期三

BS－100自动部分收集器安装圈1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关第98页，共118页，2023年，2月20日，星期三六、膜分离过程1748年法国学者AbbeNollet首次提出了膜分离现象，经过近二个世纪的摸索、研究，20世纪50年代膜分离技术才逐渐发展成为一门新兴高技术边缘学科。1963年第一个膜渗析器的诞生开创了膜分离技术的新纪元，二、三十年来得到了迅猛的发展，在各个工业领域及科研中得到大规模应用，出现了各种有价值的微滤、超滤、纳滤和反渗透等分离膜。第99页，共118页，2023年，2月20日，星期三膜分离技术的优点适用范围广；膜分离过程为物理过程，不需加入化学药剂；膜分离技术分离装置简单，占地面积小，系统集成容易；膜分离过程系统简单、操作容易，且易控制，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及。第100页，共118页，2023年，2月20日，星期三一、膜分离方法的分类透析超滤反渗透微滤电渗析液膜技术气体渗透渗透蒸发第101页，共118页，2023年，2月20日，星期三第102页，共118页，2023年，2月20日，星