焦磷酸测序专题知识讲座专家讲座

焦磷酸测序法原理及应用

（Pyrosequencing遗传分析技术）焦磷酸测序专题知识讲座第1页pyro=pyrophosphate焦磷酸

一个全新基于酶级联反应新型遗传分析技术;一套完整试验方案；很多领域广泛应用……Pyrosequencing遗传分析技术Pyrosequencing这项专利技术完全由Biotage企业拥有焦磷酸测序专题知识讲座第2页PPiATPPrincipleofPyrosequencingAPS＋Luciferin＋硫酸化酶双磷酸酶荧光素酶oxyluciferin焦磷酸测序专题知识讲座第3页Detectionofthelightlighttime焦磷酸测序专题知识讲座第4页

C GTTCCACCT

每次向反应体系中加入一个dNTP对应位置峰代表该种dNTP掺入情况峰高与掺入核苷酸数量成正比多出dNTP在加入下一个dNTP前就被降解焦磷酸测序专题知识讲座第5页AcompletesolutionforaccurategeneticdeterminationPyrosequencing

系统平台ReagentKits

SamplePrepWorkstationSoftwareInstrumentation焦磷酸测序专题知识讲座第6页PyroMarkTMIDCompletesolutionforClinicalMicrobiologyPyrosequencing

系统平台AssayDesignSW

SamplePrep

PyrosequencingFeaturingPyroGoldchemistryIdentiFireTMSW焦磷酸测序专题知识讲座第7页Pyrosequencing技术流程PCR试样预处理，取得单链模板Pyrosequencing序列分析15min/96samplesSQA:35min/96samplesSNP:10min/96samples1-2h/96samples结果分析试验设计焦磷酸测序专题知识讲座第8页Peakheightisproportionalto

thenumberofincorporatednucleotidesAllele1:ACTGAllele2:GCTG杂合子标本:焦磷酸测序专题知识讲座第9页Genotypesareclearlydistinguished纯合子杂合子ACTGCCTGCTGCCTA/GCTGCCT焦磷酸测序专题知识讲座第10页Insertions/deletionsSinglenucleotideInDels(e.g.[C])MultiplenucleotideInDels(e.g.[CGACGGT])Thesoftwaresupportsanalysisofinsertions/deletions(InDels)焦磷酸测序专题知识讲座第11页CYP2D6-A2637del(Allele3)Sequence(reverse):TCC[T]GTGT/TT/--/-焦磷酸测序专题知识讲座第12页Largedeletion3’ATGTGGCATTCCAA5’...ACGTACGCTTACACCGTAAGGTTCTAAAGGTG[CACCATGACTGGGGTTA]CAGTCATC...焦磷酸测序专题知识讲座第13页Microsatellites:TG[AATG]nTTTGGGCAAAT

8/128/8478478(9)(10)(11)(12)焦磷酸测序专题知识讲座第14页Tri-andtetra-allelicSNPsC/CT/TG/GC/TC/GT/GGenotypingoftri-allelicSNP(C/T/G)焦磷酸测序专题知识讲座第15页Multiplepolymorphisms

3’TAAGCCGAATG5’…AACATTCGGCTTACAT/GGAATGAA/C/G/TCGGTACGAACGATTTTAGA...

焦磷酸测序专题知识讲座第16页MultiplexingSNPslocatedondifferentfragments…...…..oronthesame焦磷酸测序专题知识讲座第17页PrincipleofmultiplexingDesignofsequencingprimersanddispensationorder3,5refref00,511,522,53RelativelightunitsTAGCGCACGATGT[A/G]CCTGCCACC[A/G]TTGGG

Combined

TGGACCACC[A/G]TGGTTGAG[A/G]CTGCCTG12TTGAG[A/G]CTGCCTG00,511,52TAGCGCACGATGTTGGACCACC[A/G]TGG00,511,52TAGCTGCACGATG焦磷酸测序专题知识讲座第18页UsercreatesaSNP/mutationsequencedatabaseSoftwarecalculatestheoreticalgenotypingresultsEachDNAfragmentisassignedacolor焦磷酸测序专题知识讲座第19页QuantitativepeakheightsRelativepeakheight==

peak1height

peak1height+peak2heightAllelefrequency==relativepeakheightx100(%)RelativepeakheightAllelefrequency(%)0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000010203040506070809010015%30%75%焦磷酸测序专题知识讲座第20页AdvantageandBenefitofPyeosequencingFastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShortOptimizationTimeDedicatedSoftwareDedicatedReagentKitScalable焦磷酸测序专题知识讲座第21页1.AssayDesignExampleofageneraltarget:16SgeneAssayDesignSWSpecies-specificregionin16SgenePCR-forwardPCR-reverseSequencingprimer焦磷酸测序专题知识讲座第22页2.PCR扩增一对扩增引物中一条带有生物素标识，另一条不带标识。生物素标识焦磷酸测序专题知识讲座第23页3.SingleStrandTemplatePreparation

PCR产物中加入streptavidine包被sepharosebeads振荡温育5-10min变性，生物素标识单链结合于beads并被真空吸附于VacuumPrepTool上洗涤，中和单链模板加入反应体系，与测序引物退火PCRproductimmobilizedonSepharosebeadsPSQplatewithsequencingprimerEtOHNaOHWashingbufferWater焦磷酸测序专题知识讲座第24页真实序列：遗传检测黄金标准快速实时输出：1碱基/分钟96个样本平行处理能力新一代PyroGold试剂：表现大为提升4.

PyrosequencingPyroMarkIDInstrument焦磷酸测序专题知识讲座第25页5.

PyrogramAnalysissequenceresultwithqualitygrading96samplesanalyzedsequenceresult(canbeexportedinFASTAformat)焦磷酸测序专题知识讲座第26页Pyrosequencing技术特点得到定量序列结果技术极高准确性Built-InQC重现性极佳通用型技术平台功效多样，应用领域极广能够用于任何遗传多态性分析甲基化研究平台高通量、低成本快速临床微生物诊疗试验设计灵活自动化程度高，操作简单焦磷酸测序专题知识讲座第27页WhyPyrosequencingisquantitative？lighttime焦磷酸测序专题知识讲座第28页

1分子dNTP掺入，释放出1分子PPi，生成1分子ATP，产生单位强度光信号TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA...

Triple

DoubleSingleWhyPyrosequencingisquantitative？焦磷酸测序专题知识讲座第29页1.00.00.50.50.01.0Expected1.090.050.550.560.021.05Average0.02n.d.0.030.03n.d.0.03CVC/CC/GG/Gn=190Pyrosequencing：QuantitativeAccuracyTest焦磷酸测序专题知识讲座第30页Pyrosequencing：AccurateQuantifyingRelativepeakheight==

peak1height

peak1height+peak2heightAllelefrequency==relativepeakheightx100(%)RelativepeakheightAllelefrequency(%)0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000010203040506070809010015%30%75%焦磷酸测序专题知识讲座第31页ESGCTAGTAGAGC/CESGCTAGTAGAGT/TESGCTAGTAGAGC/TWhatare”InbuiltControls”?SincePyrosequencingshowspolymorphismswithsequencecontext,youcanalwaystrustthevalidityofthedata.

焦磷酸测序专题知识讲座第32页BenefitsofBuilt-inQualityControlQC基于周围序列信息判定黄金标准从primer后第一个碱基开始——便于数据alignmentQC验证了试验成功是否详细到每一轮每一个样品万一试验失败，能够帮助分析原因，处理问题焦磷酸测序专题知识讲座第33页Pyrosequencing焦磷酸测序系统卓越表现：

99.998%

accurate

(basedonanalysisof100,000wellswithknowngenotype)

焦磷酸测序专题知识讲座第34页IntegratedSoftwarePackage整合且不停扩展软件包

SNP-SNPandmutationanalysis

AQ-IncludedinSNPsoftware-EasystatisticsfunctionSQA-Basecalling-SequencealignmentAllthreewithqualityassessmentRunningAnalyzingPlanningDocumenting焦磷酸测序专题知识讲座第35页Pyrosequencing应用Sequenceanalysis

Sequenceidentification

MicrobialtypingClonedDNAre-sequencing

mtDNA/ForensicsTransgeneticsExpressionprofilingOligoIDMicrosatellites

Knownpositions

Unknownpositionswithinhot

spotsPointmutationsInsertions/deletionsMultiplemutationsMultiplexingMutationdetectionQuantification

AllelefrequencyassessmentSNPfrequency

Tri/tetraallelicSNPfrequencyIndelfrequency

CpG-methylation

GenecopynumberLossofheterozygosityPolyploidgenomesExpressionanalysesGeneticvariation

SNPsandDIPsDi-,tri-andtetraallelic

Multiple

Multiplexing

Haplotype

Out-of-phaseAllele-specificPCR焦磷酸测序专题知识讲座第36页已发表文章焦磷酸测序专题知识讲座第37页使用Pyrosequencing技术发表研究汇报已近千篇焦磷酸测序专题知识讲座第38页发表在Nature、Science上文件焦磷酸测序专题知识讲座第39页快速判定炭疽热细菌Bacillusanthracis炭疽是一个人畜共患疾病。引发炭疽病炭疽杆菌以孢子形式存在于土壤中，在特定条件下，能够存活数十年。炭疽热潜伏期为1到6天，彻底发病则在多达60天后。抗生素能够抑制炭疽热感染，但条件是必须在接触炭疽热细菌后48小时以内使用。焦磷酸测序专题知识讲座第40页炭疽杆菌Bacillusanthracis(B.anthracis)是引发炭疽热严重感染病原细菌。从接触病原体到症状最初出现感染发展过程普通为1到6天。假如确认受到B.anthracis攻击,利用抗生素或解毒剂能够防治其感染,所以快速判定病原微生物种类和其致病力状态含有很主要意义。在起初24-48小时内摄入抗生素能够防治其传染。焦磷酸测序专题知识讲座第41页B.anthracis致病菌株有两个质粒,pXO1含炭疽热毒素产生基因(lef,cya,pag).pXO2编码包装和孢子形