口腔基础医学进展：7 荧光素酶报告基因系统

荧光素酶报告基因系统课程内容实验原理实验仪器设备实验试剂及耗材操作步骤应用举例重点内容Luciferase报告基因系统以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly

luciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。双荧光素酶报告基因测试结合萤火虫和海肾荧光素酶的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。体外分泌的荧光素基因:目前NEB公司提供新型的可在细胞外分泌的荧光素酶,分别是Gluc和Cluc,具体使用帮助可在NEB官方网站找到.转录因子活性检测实验原理（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等（2）将要检测的转录因子表达质粒，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此转录因子能够激活靶启动子则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。生物信息分析序列插入和质粒构建质粒转染和细胞培养miRNA活性检测实验原理（1）构建一个将靶3’-UTR的特定片段插入到荧光素酶表达序列后方的报告基因质粒，如pGL3-basic等（2）将要检测的miRNA，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此miRNA能够抑制靶3’-UTR则荧光素酶基因表达降低，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈反比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断miRNA是否能与此靶3’-UTR片段有作用。生物信息分析序列插入和质粒构建质粒转染和细胞培养实验试剂及耗材双荧光素酶报告基因试剂盒：实验试剂及耗材转染试剂HEK293细胞（人肾上皮细胞系）实验仪器设备转录因子活性检测实验步骤（1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入荧光素酶报告基因质粒pGL3-basic（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用（5）培养目的细胞，并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8）加入底物，测定荧光素酶的活性。（9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较。http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/3’UTR序列查询3’UTR序列查询3’-UTR生物信息分析序列插入和质粒构建质粒转染和细胞培养仪器使用应用举例应用举例活体动物成像原理：以荧光素酶标记细胞或动物模型应用优点和缺点本次课程重点内容应用荧光素酶报告基因系统检测转录因子活性实验原理应用荧光素酶报告基因系统检测miRNA活性实验原理转录因子活性检测实验原理（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等（2）将要检测的转录因子表达质粒，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此转录因子能够激活靶启动子则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。miRNA活性检测实验原理（1）构建一个将靶3’-UTR的特定片段插入到荧光素酶表达序列后方的报告基因质粒，如pGL3-basic等（2）将要检测的miRNA，与报告基因质粒和对照质粒共转染。如果此miRNA能够抑制靶3’-UTR则荧光素酶基因表达降低，荧光素酶的表达