免疫毒理学的学习资料

免疫毒理学的学习资料第1页/共73页第十三章免疫毒理学第2页/共73页31，青霉素导致过敏性休克2，利用动物实验和人类流行病学的数据资料得到的最新的研究结果显示，若臭氧浓度下降10%，非恶性皮肤瘤的发病率将会增加26%。问题第3页/共73页4内涵：外源化合物和/或其代谢物直接或间接作用于免疫系统免疫系统对外源性化学物和/或其代谢物产生的免疫应答外源化学物和/或其代谢物改变机体抗原免疫毒理学是研究外源化学物和物理因素等对机体免疫系统的损害作用、生物学机制及其危险度评价与管理，是在免疫学和毒理学基础上发展起来的一门毒理学分支学科。生物性因素第4页/共73页免疫毒理学概述免疫系统的毒性反应与机制（**）免疫毒性试验方法与评价（*）免疫毒性检验方案5主要内容第5页/共73页6免疫生物学基础概述一，免疫系统的组成及其功能

（一）免疫器官和组织

（二）免疫细胞

（三）免疫分子二，免疫应答过程及其病理反应（一）免疫应答的三个阶段（二）免疫应答的病理反应第6页/共73页7免疫器官和组织、免疫细胞及免疫分子识别自己和非己抗原，对自身耐受，清除非己，表现为免疫防御、免疫自稳和免疫监视三大功能。一、免疫系统的组成及其功能第7页/共73页8

中枢免疫器官：包括骨髓和胸腺，是造血干细胞分化为B细胞和T细胞的场所。周围免疫器官：包括脾、淋巴结、淋巴小结及全身弥散的淋巴组织。他们是成熟的T细胞和B细胞定居及对抗原应答的场所。免疫器官和组织第8页/共73页9T细胞和B细胞发育分化过程示意图第9页/共73页10免疫细胞一，免疫活性细胞：（immunoconpetentcell,ICC)指能识别特异抗原以及受抗原刺激后向母细胞转化、分裂增殖并分化为能产生免疫效应物质(如抗体、淋巴因子)的淋巴细胞,包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。二，辅佐细胞：辅佐细胞（accessorycell，简称A细胞）在免疫应答中的主要作用是呈递抗原，故又称抗原呈递细胞（antigenpresentingcell，APC），主要有：树突细胞（dendriticcell，DC）、单核细胞和巨噬细胞。三，其他免疫细胞：NK细胞，单核吞噬系统等。第10页/共73页11主要包括：抗体：是机体在抗原物质刺激下，产生的一类具有与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（inununoglobulin,Ig)。它主要存在于动物的血液、淋巴液、黏膜分泌物和组织液中，是构成机体体液免疫的主要物质。补体：是正常人和动物血清中存在的一组具有酶活性的、不稳定的、无抗体活性的、但能帮助抗体溶解靶细胞的血清球蛋白，称补体系统。细胞因子：由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的、介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子蛋白类因子—非特异性免疫效应物质。HLA分子：人类白细胞抗原。

免疫分子

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免疫应答(immuneresponse)是机体非特异性和特异性的识别并排除异己成分以维持自身稳定的全过程，因而免疫应答是整个免疫学的核心。

非特异性免疫应答主要指吞噬作用和炎症反应；

特异性免疫应答是指细胞免疫应答和体液免疫应答。抗原刺激T细胞与B细胞产生致敏T细胞和(或)抗体称正应答；未产生致敏T细胞或抗体的负应答即耐受。

二、免疫应答过程及其病理反应

概念第12页/共73页13T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。细胞免疫（cellularimmunity）第13页/共73页14

（一）免疫应答的3个阶段

第14页/共73页15NK细胞效应过程ADCC第15页/共73页16异常的免疫反应包括：免疫抑制和免疫增强。免疫增强：是指机体过度的或不适当的免疫反应状态。病理反应：超敏反应和自身免疫反应

（二）免疫应答的病理反应第16页/共73页17超敏反应主要是指机体再次接触同一抗原时所发生的不同形式的免疫病理损害过程。I型速发型；II型细胞毒型或细胞溶解型；III型免疫复合物型或血管炎型；IV型迟发型。第17页/共73页18第18页/共73页19自身免疫反应是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）自身致敏淋巴细胞，引起机体病理损害甚至导致疾病的过程。自身免疫性疾病的临床表现很复杂，目前已知至少有20多种，可以分为器官特异性和器官非特异性。如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，系统性红斑狼疮(SLE)。第19页/共73页20自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)。侵犯皮肤和多脏器的一种全身性自身免疫病。某些不明病因诱导机体产生多种自身抗体(如抗核抗体等)，导致：①自身抗体与相应自身抗原结合为循环免疫复合物，通过III型超敏反应而损伤自身组织和器官；②抗血细胞自身抗体与血细胞表面抗原结合，通过II型超敏反应而损伤血细胞。临床表现：皮疹常见，约40%患者有面部典型红斑称为蝶形红斑。急性期有水肿、色鲜红，略有毛细血管扩张及磷片状脱屑，严重者出现水疱、溃疡、皮肤萎缩和色素沉着。手掌大小鱼际、指端及指（趾）甲周红斑，身体皮肤暴露部位有斑丘疹、紫斑等。出现各种皮肤损害者约占总患病数的80%，毛发易断裂，可有斑秃。15－20%患者有雷诺现象。口腔粘膜出现水泡、溃疡、约占12%。少数患者病程中发生带状疱疹。第20页/共73页第一节

免疫毒理学概述（一）免疫毒理学的主要研究内容1，免疫毒性及作用机制研究2，免疫毒性评价的方法学研究3，免疫毒性的危险度评价21第21页/共73页第一节

免疫毒理学概述（二）外源化学物对免疫系统作用特点1，反应的灵敏性2，反应的选择性3，剂量-反应关系复杂22第22页/共73页23怎样提高免疫力12月5日是世界强化免疫日第23页/共73页24第二节免疫毒性作用及其机制（重点）

免疫抑制免疫抑制是指由于各种因素影响，使得机体对抗原的应答能力低下甚至缺失的现象。造成免疫抑制的因素很多，包括疾病、应激、营养等。由病原微生物感染而引起的免疫抑制尤为严重，人类的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）就是由病毒引起免疫抑制的典型代表。超敏反应超敏反应（hypersensitivity），即异常的、过高的免疫应答。即机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生致敏淋巴细胞或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应。又称变态反应。自身免疫是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）自身致敏淋巴细胞，引起机体病理损害甚至导致疾病的过程。第24页/共73页25免疫抑制体液免疫细胞免疫功能表现抗感染能力降低肿瘤易感性增加具有免疫抑制作用的外源化学物种类：①药物：肿瘤细胞减灭剂（化疗药物）、麻醉药等②工业化学物：有机溶剂、多卤代芳烃等③重金属及其化学物、空气污染物等。④嗜好品：乙醇、烟草等。一、免疫抑制第25页/共73页外源化学物引起免疫抑制的机制

直接作用间接作用免疫器官免疫细胞免疫分子功能改变结构改变混合改变神经系统内分泌系统继发于其它靶器官毒性代谢活化激素水平改变第26页/共73页27第27页/共73页28外源化学物免疫抑制的机制1，干扰免疫细胞在胸腺和骨髓的发育（1、2）2，干扰抗原提呈机制（3、4）3，干扰T细胞功能（5）4，干扰B细胞功能（6）5，干扰细胞增殖（7）直接作用第28页/共73页29外源化学物免疫抑制的机制间接作用影响神经内分泌系统的调节功能继发于其它靶器官毒性第29页/共73页NF-κB信号通路第30页/共73页31二、超敏反应常见的引起超敏反应的主要外源化学物有：①药物：青霉素类、磺胺类等；②食品：蓖麻子、生咖啡豆等；③化学品：美容护肤品、香水等；④工业化学品：乙二胺、邻苯二甲酸酐等；⑤植物：毒常青藤、橡树等；⑥混合有机体：棉尘、木尘等；变态反应第31页/共73页321）外源化学物本身作为抗原或半抗原而引发超敏反应。直接2）改变抗体免疫应答的敏感性或强度而导致超敏反应。直接或间接引起超敏反应机制：Coombs和Gell将超敏反应分为四型，代表组织损伤的四种不同机制第32页/共73页33I型第33页/共73页34I型超敏反应机制致敏阶段发敏阶段第34页/共73页35II型第35页/共73页36II型超敏反应机制第36页/共73页37III型第37页/共73页38III型超敏反应机制只有沉积于局部才有致病作用第38页/共73页39IV型致敏此时致敏是产生活化T细胞和记忆T细胞，而不是产生抗体第39页/共73页40IV型超敏反应机制第40页/共73页41三、自身免疫第41页/共73页421）引发机体针对自身抗原产生自身抗体进行免疫应答。2）引发机体产生针对自身抗原的自身应答性T细胞进行免疫应答。3）造成自身隐蔽抗原的暴露或释放、改变自身抗原或形成新的自身抗原，从而引起自身免疫。4）改变血细胞或其他组织细胞的抗原性，这种改变了的抗原刺激机体产生自身抗体。5）影响正常的免疫调节功能，如激活对自身抗原处于耐受态的T细胞，或通过抗原提呈细胞表面辅助刺激因子异常表达，或引起Th1和Th2功能失衡，引起自身免疫。外源化学物引起自身免疫的机制第42页/共73页43因先天性或继发性免疫系统功能不全的疾病。发生免疫缺陷的原因：先天性免疫系统遗传因素异常、感染、药物作用、外源化学毒物接触、罹患疾病、营养不良等。免疫缺陷的主要临床症状：1）高度可疑：反复感染、慢性感染、偶见的传染因子、感染与治疗效果间的关系不甚明确。2）中度可疑：皮疹、慢性腹泻、严重发育不良、反复性脓肿、反复性骨髓炎、肝脾大。3）特殊的免疫缺陷症状：共济失调、毛细血管扩张等。免疫缺陷(immunodeficiency,ID)第43页/共73页常见的具有免疫毒性作用的物质有机物无机物第44页/共73页第45页/共73页46二恶英的免疫毒性靶器官：免疫系统（胸腺）低剂量二恶英即可攻击免疫系统。猴子暴露二恶英的浓度仅为10ng/Kg时，白细胞数量就会降低；啮齿类动物，围产期暴露于TCDD会影响胸腺的发育，导致细胞免疫的持续性抑制。而且在围产期暴露比成人暴露引起的T细胞功能减弱更大、更持久。第46页/共73页47直接作用：对体液免疫和细胞免疫均有抑制作用，能减少B细胞的数量；间接作用：通过影响内分泌系统发挥作用（TCDD和相关化合物能干扰内分泌系统，改变糖皮质激素、性类固醇激素、甲状腺激素、生长激素等的活性）。二恶英的作用机制第47页/共73页48金属的免疫抑制作用铅、汞、镍和镉等金属与CD4+细胞的激活或引起抗体反应和细胞免疫抑制有关；铅：降低对感染性疾病的抵抗力砷化物：患病毒性带状疱疹的发病率较高第48页/共73页49缺锌影响机体免疫功能影响淋巴细胞增殖分化影响免疫记忆影响免疫细胞分泌细胞因子影响吞噬细胞和NK活性第49页/共73页50铅对免疫功能的影响铅具有免疫毒性，在较低剂量可引起免疫功能改变，增加机体对内毒素和病原体的易感性体液免疫：抗体减少、B细胞表面受体减少、免疫记忆丧失细胞免疫：增殖分化障碍非特异性免疫：巨噬细胞数量减少，功能降低第50页/共73页汞对免疫功能的影响中枢神经系统的不可逆损伤大剂量导致免疫功能下降和免疫抑制小剂量引起自身免疫性疾病与遗传因素和个体敏感性关系密切与TH1/TH2失衡有关以肾炎为主抑制巨噬细胞分泌TNF、NO引起细胞凋亡第51页/共73页52

第三节免疫毒性作用的试验方法与评价

第52页/共73页53一、检测方法（一）免疫病理学检查（二）免疫功能检测（三）超敏反应和自身免疫反应（四）免疫细胞因子的检测第53页/共73页54（一）免疫病理学检查观察免疫器官大小、重量和大体形态；观察胸腺、脾脏、淋巴结和骨髓的组织结构和细胞类型；检查局部黏膜相关淋巴组织（包括肠、皮肤、鼻、支气管等黏膜相关淋巴组织）利用荧光标记单克隆抗体和流式细胞仪观察淋巴细胞表面标记检查淋巴细胞表型用常规染色和免疫组化观察组织结构第54页/共73页55FIG.2.(A)Lowmagnificationofanormalthymusfromacontrolratexhibitingacortex:medullaratioofapproximately2:1(×40).(B)Highmagnificationofanormalthymuscortexfromthesameratin(A)(×400).Thearrowindicatesanapoptoticbody.(CandD)Thymusfromarattreatedwith5mgPFNA/kg/day(C)Thethymusshowsacortex:medullaratioofapproximately1:1(×40).(D)Increasednumbersofapoptoticlymphocytesandtingiblebodymacrophageswithintracytoplasmicapoptoticbodies(arrows)areevidentinthisthymus(×100).第55页/共73页（二）免疫功能的测定免疫功能检测获得性免疫应答固有性免疫应答细胞免疫功能检测体液免疫功能检测巨噬细胞功能检测NK细胞活性测定宿主抵抗力试验ELISA免疫电泳法血凝法空斑形成细胞细胞毒性T细胞杀伤试验T淋巴细胞增值试验迟发型超敏反应NK细胞对敏感肿瘤细胞的溶解作用放射性核素铬标记的鸡红细胞吞噬法宿主抵抗力试验模型第56页/共73页57NK细胞活性测定主要观察NK细胞对敏感的肿瘤细胞的溶解作用。将接触和未接触外源化学物的动物脾淋巴结与同位素（51Cr）标记的靶细胞共同孵育，NK细胞溶解肿瘤靶细胞，将同位素释放至培养液。培养结束后离心分离上清液，用γ计数仪测定同位素强度，51Cr的放射性脉冲与NK细胞活性成正比可反应NK细胞活性。NKcelltargetcell51Cr自然杀伤组第57页/共73页58巨噬细胞功能检测放射性核素铬标记的鸡红细胞吞噬法。从小鼠腹腔收集巨噬细胞，在24孔板贴壁生长，加51Cr-cRBCs孵育后，弃去上清中的51Cr-cRBCs，再氯化铵短暂培养，去除与巨噬细胞结合但未被吞噬的51Cr-cRBCs。最后用NaOH溶解巨噬细胞，测定溶解液中的放射强度。第58页/共73页59体液免疫功能检测一般用特意性抗原免疫动物，刺激脾B细胞活化并分泌抗体，然后观察抗体生成量或抗体形成细胞数。前者用ELISA、免疫电泳法、血凝法等直接测定血清抗体浓度，后者常用空斑形成细胞试验。第59页/共73页60细胞免疫功能检测最常用的方法是细胞毒性T细胞杀伤试验（CTL）、T淋巴细胞增殖试验和迟发型超敏反应。CTL试验评价脾T-淋巴细胞识别和溶解经抗原处理靶细胞的能力。淋巴细胞增殖功能一般选用不同有丝分裂原刺激体外培养的淋巴细胞，然后观察淋巴细胞增殖情况。DHT试验先用某种抗原致敏，再用相同抗原作皮肤试验，观察局部以出现红肿为特征的迟发型超敏反应。第60页/共73页61一般用被动皮肤过敏试验（PCA）、主动皮肤过敏试验（ACA）、全身主动皮肤过敏试验（ASA）检测Ⅰ型超敏反应，多用于检测蛋白或多肽的致敏性。抗体滴度检测。目前没有预测药物II型和III型超敏反应的标准实验方法。检测Ⅳ型超敏反应最常用的是局部封闭涂皮试验（Ｂuechertest,BA)、豚鼠最大值试验（GPMT)和豚鼠迟发性皮肤超敏反应（DHR）。目前还没有检测药物自身免疫反应的标准方法。鼠局部淋巴结试验（LLNA）可以用于自身免疫反应。免疫原性比较困难。人与动物区别；药物的生物学特征很容易改变。假过敏或者类过敏反应。不良免疫刺激，与假过敏之间有交叉。（三）超敏反应和自身免疫反应第61页/共73页62（四）免疫细胞因子的检测检测方法主要有：生物学测定、免疫学测定、分子生物学测定和流式细胞仪测定等。生物学测定（生物活性测定），主要是根据各种细胞因子的不同生物活性检测。免疫学测定，主要利用细胞因子蛋白或多肽的抗原性，获得特意抗血清或单克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。常用有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫试验（RIA）和免疫印记（immun

blot）等

第62页/共73页63第63页/共73页64１．分子生物学技术的应用免疫沉淀法、Western-Blot分析技术检测、

PCR技术、原位杂交技术、Ｎorthern印记和斑点杂交技术等。分子生物学技术的应用主要包括：早期细胞损害的生物损伤的诱导反应、细胞结构和增殖变化的检测、细胞损伤的诱导反应和毒性损伤导致的特异