DB36T 1747-2023 新型鹅星状病毒病诊断技术规程

ICS11.220CCSB41

DB36发布发布江西省市场监督管理局2023080120230210江 西 省 地 方 标 准DB36/T1747—2023新型鹅星状病毒病诊断技术规程DiagnostictechnicalregulationsfornovelgooseastrovirusdiseaseDB36/T1747DB36/T1747—2023DB36/T1747DB36/T1747—2023附录F（资料性附录） 新型鹅星状病毒RT-PCR引物、荧光RT-PCR的引物和探针、RT-LAMP引物12参 考 文 献 14目  次前 言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1临床诊断 1实验室诊断 2综合判定 6附录A（资料性附录） 病毒分离所需仪器设备和试剂耗材 7附录B（资料性附录） 样品的采集、处理、运输及保存 8附录C（资料性附录） RT-PCR所需仪器设备和试剂耗材 9附录D（资料性附录） 荧光RT-PCR所需仪器设备和试剂耗材 10附录E（资料性附录） RT-LAMP方法所需仪器设备和试剂耗材 11IIII前 言本文件按照GB/T1请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所。4.4.1 流行病学31下列术语和定义适用于本文件。3.1新型鹅星状病毒novelgooseastrovirus,NGoAstV（Astroviridae）（Avastrovirus），（Astroviruses,AstV）是一种呈球形的RNA25nm～355个～63.2新型鹅星状病毒病novelgooseastrovirusdisease,NGoAstVD指由新型鹅星状病毒引起的以雏鹅尿酸盐沉积在关节和（或）内脏为主要病理特征的传染病。。3.3鸡肝癌细胞系chickenhepatomacellline,LMHLMH4 临床诊断新型鹅星状病毒病诊断技术规程范围本文件规定了新型鹅星状病毒病的术语定义、临床诊断、实验室诊断和综合判定技术要求。本文件适用于新型鹅星状病毒病的诊断和流行病学调查。规范性引用文件GB19489 实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义22实验室生物安全要求按照GB19489执行。病毒分离试验设备和试剂耗材准备见附录A，样品准备见附录B。细胞分离细胞的准备细胞的准备工作包括以下内容：37℃（0.25%胰酶DMEM/F12LMH细胞用无菌PBS洗涤2次，弃去PBS；0.25%1mL加入到细胞培养瓶；375CO224h～36h80%时，用于细胞分离。病毒的分离培养病毒的分离培养工作包括以下内容：PBS3次后，将处理好的样品接种到单层细胞上，每孔0.2mL～0.4mL；5 实验室诊断水平传播。各品种鹅均易感，5日龄～20330%～40%，50%。临床症状患鹅精神沉郁，食欲减退，饮水量增加，消瘦，四肢瘫痪，排白色稀便，发病高峰期约在7日龄～14日龄。病理变化剖检病变组织学病变临床诊断结果判定符合4.14.2临床症状和4.333试验设备和试剂耗材准备见附录C。RNA提取待检组织样品总RNA，提取的RNA立即用于反转录，否则置于-80℃冰箱冻存。cDNA采用50μL体系，于无菌无酶EP管中依次加入RNA模板5μL、Buffer缓冲液10μL，随机引物2μL、dNTPs(2.5mMeach)4μL、M-MLV反转录酶(200U/μL)1μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)2μL，补充无菌水至总体积共50PCR仪中进行cDNA255min5045min852min45min的程序进行一个循环，cDNA合成后进行PCR扩增或于-20℃保存备用。PCR配置PCR反应液，在样品制备区加样。采用25μL反应体系，见表1所示。表1 PCR反应体系1h～2h15minPBS3次，加入细胞维持液，每孔1mL；375%CO25d，每天观察细胞状态；35000rpm10min后取上清用于检测或置于-80℃保存。鹅胚分离种蛋准备将种鹅蛋（新型鹅星状病毒阴性）置于孵化器中37℃下孵育10d～11d，用于病毒分离。鹅胚接种将待检样品以0.2mL/胚的剂量经绒毛尿囊膜途径接种10日龄～11日龄鹅胚，37℃恒温培养箱中培养，每天照蛋2次，连续观察6d，并记录死胚情况。尿囊液收集弃掉接种后24h内死亡的鹅胚，若接种2d～6d内鹅胚出现死亡，则收集死亡鹅胚的尿囊液；若接种6d内鹅胚不出现死亡，则收集6d活胚的尿囊液。病毒的鉴定RT-PCR试剂体积（μL）2×PCRMix12.5上游引物（10μmol/L）1.0下游引物（10μmol/L）1.0模板cDNA2.0无RNA酶去离子水8.5总体积25.0将上述成分分别加入荧光定量将上述成分分别加入荧光定量PCR管中，轻轻混合均匀，瞬时离心，打开荧光定量PCR仪和联机计PCR管置于荧光定量PCR943053045个循环；4终止反应。4RNA同5.2.1.1。cDNA同5.2.1.2。PCR将试剂盒中预混液、引物和探针取出，置于冰上直至融化，将下列试剂依次加入到无RNA酶的荧光定量PCR管中。采用20μL反应体系，见表2所示。表2 荧光定量PCR反应体系PCR95℃预变性330s，5530s，7245s，35个循环；最后72℃延伸8min，4℃结束反应。PCR将制备好的1.0%（带加样孔的一端在阴极浸过胶面。DNAMarker、阴性对照产物、PCR产物和阳性对照产物各取7μL加入胶孔内，在110V电压下电泳20min～40min；在凝胶成像分析系统下观察、拍照，并记录结果。RT-PCR试验成立的条件489bp试验结果的判定489bpPCR阳性。否则为阴性，必要时，对扩增片段进行序列测定。RT-PCR试验设备和试剂耗材准备见附录D。试剂体积（μL）2×荧光定量PCR预混液10.0上游引物(10μmol/L)0.4下游引物(10μmol/L)0.4探针(10μmol/L)0.4cDNA1.0无RNA酶去离子水7.8总体积20.0PCRPCR程序64℃反应60min，然后85℃反应2min进行酶灭活处理。5.2.3.4 LAMP5.2.3.5.1 试验成立条件55.2.3.3 LAMP配置LAMP反应液，在样品制备区加样。采用25μL反应体系，见表3所示。表3 LAMP反应体系5.2.2.4 PCR试验成立的条件试验结果的判定判定结果按照以下要求：Ct值＜30，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在新型鹅星状病毒，判为阳性；CtCt值＞35，表明样品中无新型鹅星状病毒，判为阴性；30≤Ct值≤35Ct值＜30RT-LAMP试验设备和试剂耗材准备见附录E。RNA同5.2.1.1。cDNA同5.2.1.2。试剂体积（μL）2×buffer12.5酶混合物(EM)1.0内引物-NGoAstV-FIP1.0内引物-NGoAstV-BIP1.0外引物-NGoAstV-F30.5外引物-NGoAstV-B30.5环引物-NGoAstV-LB1.0环引物-NGoAstV-LF1.0cDNA2.0无RNA酶去离子水4.5总体积25.066反应结束后，取TE染料加入产物中，混匀后在紫外线下观察。在阳性对照出现黄绿色荧光，同时阴性对照不出现黄绿色荧光的情况下，试验成立。5.2.3.5.2 结果判定在紫外线下被检样品出现黄绿色荧光，判为阳性；在紫外线下被检样品未出现黄绿色荧光，判为阴性。6 综合判定符合临床诊断规定的疑似病例经5.2.15.2.25.2.377A.2.1 仪器设备与试剂耗材（2μL-20μL20μL-200μL100μL-1000（1mL5（1.5mL15mL50RNA酶的带滤芯枪头、75%酒精、碘伏、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、孵化箱。A.2 鹅胚分离细胞培养液在DMEM/F12培养液中加入10%FBS、1%青霉素-链霉素溶液（1万U/mL），用于LMH细胞培养。细胞维持液在DMEM/F12培养液中加入2%FBS1%青霉素-（1LMH细胞维持。附 录 A（资料性附录）病毒分离所需仪器设备和试剂耗材细胞分离仪器和设备（2μL20μL20μL-200μL100μL-1000mL、15mL、50mL）、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、漩涡振荡器、细胞培养箱、细胞培养瓶（25㎝2、75㎝2、175㎝2）。试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清（FBS）、胰酶、青霉素-链霉素溶液。分离病毒用细胞鸡肝癌细胞系（LMH），LMH培养特性见参考文献[1]。培养液配制附 录 B（资料性附录）样品的采集、处理、运输及保存B.1 仪器设备与耗材（2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、无菌注射器（1mL、5mL）、无RNA酶的1.5mLRNA0.22μm（4-20-80℃）样品采集可采标NY/T541。采集和样品前处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子，采集过程中样品不得交叉污染。样品采集过程包括以下要求：50mL离心管或一次性洁净塑料自封袋，密封、编号，待检；1.5mL1.5mL离心管中，加盖、编号，待检；31mLPBS的无菌离心管中，盖上管盖并编号，10000rpm5min后取上清备用。样品处理组织样品在生物安全柜内用灭菌剪刀剪碎后按照1:5加入无菌7.40.01融3次后，在4下10000rpm离心15min，上清液经0.22μm滤器过滤后-80℃冰箱保存。细胞上清液和鹅胚尿囊液将细胞培养液和鹅胚尿囊液在4℃下10000rpm离心15min，将上清液转入灭菌的1.5mL离心管中，依据原样品地编号。899随机反转录引物Random9反转录引物。RT-PCR引物针对鹅星状病毒的RT-PCR检测引物，参照附录F。附 录 C（资料性附录）RT-PCR所需仪器设备和试剂耗材仪器设备与耗材PCRμL-2.5μL、2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、无RNA酶的1.5mL离心管、无RNA酶的PCR管、无RNA酶的带滤芯枪头。试剂商品化RNA提取试剂盒、无RNA酶去离子水、反转录试剂盒（包括Buffer缓冲液、M-MLV反转录RNA酶抑制剂2×PCRMixdNTPs(2.5nmol/Leach)DNAMarkerTis-乙酸电泳缓冲液1%（新型鹅星状病毒（阴性尿囊液或正常细胞）。引物1010特异反转录引物Random9反转录引物。荧光定量RT-PCR引物和探针针对鹅星状病毒的荧光PCR引物和探针，参照附录F。附 录 D（资料性附录）荧光RT-PCR所需仪器设备和试剂耗材仪器设备与耗材PCR（0.1μL-2.5μL2μL-20μL20μL-200μL100μL-1000RNA酶的1.5mLRNA酶的荧光定量PCRRNA酶的带滤芯枪头。试剂商品化RNA提取试剂盒、无RNA酶去离子水、反转录试剂盒（包括Buffer缓冲液、M-MLV反转录RNA酶抑制剂PCRdNTPs(2.5nmol/Leach)（新型鹅星状病毒、阴性对照（阴性尿囊液或正常细胞）。引物1111Random9反转录引物。E.3.2 RT-PCR引物针对鹅星状病毒的RT-LAMP检测引物，参照附录F。附 录 E（资料性附录）RT-LAMP方法所需仪器设备和试剂耗材仪器设备与耗材（0.1μL-2.5μL2μL-20μL20μL-200μL、100μL-1000μL）、无RNA酶的1.5mL离心管、无RNA酶的PCR管、无RNA酶的带滤芯枪头。试剂商品化RNA提取试剂盒、无RNA酶去离子水、反转录试剂盒（包括Buffer缓冲液、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂）、商品化LAMP扩增试剂盒、TE可视染料、阳性对照（新型鹅星状病毒）、阴性对照（阴性尿囊液或正常细胞）。引物随机反转录引物1212F.4 引物和探针的稀释表F.3 RT-LAMP检测用引物和探针见表F.3。F.3 RT-LAMP检测引物附 录 F（资料性附录）新型鹅星状病毒RT-PCR引物、荧光RT-PCR的引物和探针、RT-LAMP引物新型鹅星状病毒RT-PCR检测引物见表F.1。表鹅星状病毒检测用引物和探针引物名称引物序列（5ˊ→3ˊ，上下两行分别为上下游引物序列）基因用途NGoAstV-FATTCTTGGCTCGGTTGTC489ORF2RT-PCRNGoAstV-RCCTGTGTTGCTCCTTCTC新型鹅星状