真实世界研究方法在中药临床评价中的应用

真实世界研究方法

在中药临床评价中的应用2中药新药临床评价研究技术平台3.国际多边互认数据管理和统计平台4.国际公认的人体生物医学伦理规范5.符合国际规范的临床试验质控平台7.符合国际规范的I期临床试验平台

8.三种疾病临床示范研究和评价指南建立符合国际规范的中药新药临床评价技术平台6.符合国际规范的临床再评价平台1.病-证-症关联的证候疗效评价规范2.符合国际规范的临床研究设计平台3中药上市后临床再评价RWS研究:真实世界研究(TheRealWordStudy，

RWS)，它是RCT研究的进一步补充。数据来源主要基于临床登记。

CER研究的模范案例—GRACE。建立上市中药的医院登记监测平台，是临床再评价的核心内容之一。RCT研究:随机对照试验，证据等级最高，目标是国际合作设计，国际合作指控，可能的情况下，国际合作观察，国际核心期刊发表。PSS研究:PSS（Post-marketSaftyStudy，药物上市后安全性研究），包括安全性监测登记研究、病例对照研究、队列研究等。4中药上市后临床再评价PER研究:PER（PharmacoeconomicResearch，药物经济学研究），包括成本-效益分析、成本－效果分析和成本－效用分析。理论升华:一个大品种，企业重点药物，理论升华具有重大意义，可以丰富药品内涵，更能促进中医发展。如通心络胶囊与络病理论。我们的经验:RWS-RCT-理论升华。传统中成药临床再评价研究具有更重要的意义。昨夜西风凋碧树，独上高楼，望尽天涯路（经验时代）衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴（偱证时代）众里寻他千百度，回头蓦见，那人正在灯火阑珊处（真实世界）王国维《人间词话》经验时代

活络效灵丹，……治气血凝滞，痃癖症瘕，心腹疼痛，腿疼臂疼，内外疮疡，一切脏腑积聚，经络湮淤。……自拟得此方以来，数年之间，治愈心腹疼痛者，不可胜计矣。

——张锡纯《医学衷中参西录》循证时代

随机对照试验为核心的研究设计理念，为试验结论的可靠性提供了有效保障从经验到证据从个体到群体医学研究的一场革命循证时代

相传欲试人参，但使二人同走，一与人参含之，一不与，度走三、五里许，其不含着必大喘，含者气息自如，其参乃真也。

——苏颂《嘉裕图经本草》循证时代

芪参益气滴丸对心肌梗死二级预防的临床试验（MISPS～TCM）研究张伯礼院士中国冠心病二级预防研究（CCSPS)陆宗良教授循证时代---REVERSAL主要目标：逆转动脉粥样硬化研究人群：血管内超声(IVUS)冠状动脉狭窄均在70％以上，654例年龄在34岁－78岁的症状性冠状动脉疾病的患者分组：随机分为两组试验药物：阿托伐他汀80mgVS普伐他汀40mg疗程：18个月结果：强化降脂治疗可以促进动脉粥样硬化的消退ATPⅢ，PROVE-IT，AtoZ，TNT，IDEAL早期使用、早期获益；长期使用、长期获益；强化降脂、更大获益真实世界的问题没有做血管内超声检查的患者能强化降脂吗？肝功能不好的患者能强化降脂吗？中国人群能强化降脂吗？强化降脂的潜在危险是什么？强化降脂的实际临床应用情况怎么样？为什么医生不能全面接受和应用循证证据？关于RWS近20年，发展出,RWS一种全新的方法，围绕真实世界的研究探索必将引发医学研究上的一场革命干预效果分类效力Efficacy：随机化、安慰剂对照，有选择的研究对象，多中心相对效力RelativeEfficacy：随机化、阳性药对照，或三臂试验，有选择的研究对象，多中心效果Effectiveness：真实世界观察性研究，有异质性的研究群体，实际治疗环境，与其他治疗措施的实际对比相对效果RelativeEffectiveness：关于几种干预措施的真实世界观察性研究，或实用性随机对照试验。实际临床效果评价关于CERRWS研究方法实用型临床试验(pragmatictrials)自适应性设计(adaptivedesigns)队列研究（CohortStudy）病例对照研究（Case-Controlstudy）病例队列研究（Case-Cohortstudy）临床登记注册(clinicalregistries)目前美国主张使用注册临床资料(clinicaldataregistries)的方式来真实世界研究（TheRealWorldStudy）可以实现有效性、安全性、经济学一体化评价真实世界研究方式以疾病为切入点GRACE：GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents(急性冠脉综合症全球注册事件）

以药品为切入点CENITstudy：依那普利联合尼群地平治疗高血压的真实世界研究GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents背景

虽然，在世界范围，已经完成大量干预急性冠脉综合征的临床试验，特别是早期冠脉再灌注治疗（溶栓或冠脉介入），已经被美国和欧洲推荐为标准治疗。但是，各个国家和地区，再灌注方法的选择差异很大，再灌注治疗的实际使用率并不高，甚至对某些人群，比如老年人，再灌注治疗的利弊仍存在许多争议。事实上，医生面临的巨大挑战是，如何将大量结论并不完全相同临床试验结果，运用到真正的医疗实践当中去。GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents目标：研究急性冠脉综合征（包括不稳定心绞痛和ST段抬高性心肌梗死）住院患者临床特征、地域差异、治疗现况以及主要临床结局，预期持续改善急性冠脉综合征患者的治疗和远期临床结局。总体设计：大型、国际、多中心、持续性观察研究（真实世界研究）GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents开始时间：1999年4月，预期持续观察。国家：开始14个。来自北美、南美、欧洲、澳大利亚和新西兰。ClusterSites（群组）：18个（美国5个），群组选择依据：能够代表这个国家（地理区域）的不同人口特征、临床特征和治疗特征的人群。GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents医院：47个。每个群组可以有多家医院，以便能够反应这个地区急性冠脉综合征的总体情况医院的选择和某个地理区域的医院数量和患者数量直接相关医院大小、急性监护床位数、医疗设备各不相同，以期有广泛的代表性而不是局限于特定的人群。GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEventsPopulation-basedCluster（以人口为基础的群组）USAMassachusettsBostonResidentsofFalmouthandHyannis(n=108,800)CapeCodHospital,FalmouthHospital特殊情况（南美洲）GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents样本：每年10,000，依据主要是这些医院住院的急性冠脉综合征患者数量。入选标准：符合急性冠脉综合征诊断18岁以上送达医院时存活患者没有合并重大疾病，包括车祸、外伤、严重胃肠道出血、手术等。其他疾病正在住院的病人发生急性冠脉综合征不能入选转院来的病人可以入选转送其他医院的病人停止观察，但要注明转院原因如果已经超过6个月观察期，患者可以重复入选，但是，必须用一个新的病人号入选必须符合急性冠脉综合征诊断标准，但一种情况例外，患者住院1天内就死亡，当时不符合标准，但死亡原因确定是由于急性冠脉综合征。GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents患者识别前瞻性或回顾性识别严格统一对入选标准的认识要求患者连续入选并不是所有的患者都入选从第一个月的第一天开始连续入院的患者都入选，直到到达要求的病人数每一群组每年入选的患者数是600人，每个医院根据具体情况要求病例数。定期稽查各个群组GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents观察内容：6页的核心病例报告表，包括人口学、症状、病史、到达医院距离症状开始的时间、临床用药和心电图特点等信息。观察时点医院内转归出院后6个月转归GRACE研究

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents伦理（只用于前瞻性识别）：每家医院都要通过伦理委员会认可签署知情同意书数据管理和统计分析核心病例报告表直接扫描进入数据库人工核查数据中心（PremierResearch,Philadelphia,PA,USA）国际GRACE合作中心（CenterforOutcomesResearch,UniversityofMassachusettsMedicalSchool,Worcester,MA,USA）数据核查、疑问和定期稽查GRACE研究成果

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEventsAcomparisonbetweenB-typenatriureticpeptide,globalregistryofacutecoronaryevents(GRACE)scoreandtheircombinationinACSriskstratification.

PrehospitalDelayinPatientsWithAcuteCoronarySyndromes(fromtheGlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents[GRACE]).

N-terminalproBtypenatriureticpeptidecomplementstheGRACEriskscoreinpredictingearlyandlatemortalityfollowingacutecoronarysyndrome

Thrombocytopeniainpatientswithanacutecoronarysyndrome(fromtheGlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents[GRACE]).

GRACE研究成果

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEventsMagnitudeandprognosisassociatedwithventriculararrhythmiasinpatientshospitalizedwithacutecoronarysyndromes(fromtheGRACERegistry).

Timecourseofeventsinacutecoronarysyndromes:implicationsforclinicalpracticefromtheGRACEregistry.Predictivefactorsofrecurrentanginaafteracutecoronarysyndrome:theglobalregistryacutecoronaryeventsfromChina(Sino-GRACE).

GRACE研究成果

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEventsTreatmentoftheacutecoronarysyndromeinGermany:experiencesinaGermanclusteroftheGRACEregistry

Predictingoutcomeinpatientswithacutecoronarysyndrome:evaluationofB-typenatriureticpeptideandtheglobalregistryofacutecoronaryevents(GRACE)riskscore.

Interactionsbetweenheparins,glycoproteinIIb/IIIaantagonists,andcoronaryintervention.TheGlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents(GRACE).

Bleedingeventswithantithrombotictherapyinpatientswithunstableanginaornon-ST-segmentelevationmyocardialinfarction;insightsfromalargeclinicalpracticeregistry(GRACE).

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents(GRACE)hospitaldischargeriskscoreaccuratelypredictslong-termmortalitypostacutecoronarysyndrome.

2007年GRACE研究中冠状动脉支架置入术后联用华法林和抗凝剂治疗：只用一种抗凝药物是否安全有效？目的：为了明确冠状动脉支架置入术后服用华法林的患者中应用单一抗凝剂或双抗凝剂治疗的相关因素，同时观察服用华法林加用单一抗凝剂(阿司匹林或噻吩并吡啶)与加用双抗凝剂治疗相比是否会导致不良后果的增加。方法：800例急性冠状动脉综合征患者住院行冠状动脉支架置入术，出院时给予华法林+双抗凝剂治疗(n=580)或华法林+单一抗凝剂治疗(n=220)，对这些患者的数据进行分析。结论：支架置入术后采用单一抗凝剂或双抗凝剂联合华法林治疗较常见。在此项观察性研究中，两组间术后6个月内死亡和心肌梗死无差异。2011年GRACE研究：急性冠脉综合症病人接受与不接受慢性透析的结局比较背景：慢性肾衰患者终末期常常合并有急性冠脉综合症。我们对透析患者的ACS自然发展史知道的甚少。我们评估在慢性肾衰合并ACS患者做透析后的症状，治疗和结局。方法：这些患者从1999年到2007年被14个国家的123所医院收入组，一共是55189个病人，579人从入组开始被要求透析。结论：1.接受透析的患者较之不接受透析的患者更易发生高血压，心肌梗死，经皮冠状动脉介入术，冠状动脉搭桥手术，糖尿病，中风，心衰等疾病2.579列透析患者中50%发生非S-T段抬高性心肌梗死，而在未接受透析病例中只有33%发生非S-T段抬高性心肌梗死。2011年GRACE研究：急性冠脉综合症病人接受与不接受慢性透析的结局比较结论：3.接受透析患者更容易并发2级或者3级心衰。4.总起来说经皮冠状动脉介入术在透析患者的ACS患者中很少使用。S-T段抬高的透析患者也很少运用任何再灌注术。5.接受透析的患者显著增加了院内死亡率(12%vs4.8%)。6.在这些好转出院的患者中，接受透析患者的死亡率较未接受透析的患者的死亡率高(13%vs4.2%)，再次入院(31%vs18%)和再次发生心肌梗死(7.6%vs2.9%)的比例也相对较高，而使用GRACE危险评分标准对死亡率和心肌梗死的预测是低于实际的。GRACE研究的启示

GlobalRegistryofAcuteCoronaryEvents持续性研究以人口为基础的研究循证证据与真实世界相结合时发展方向真实世界研究需要建立在循证证据的基础上中医的真实世界中医真实世界研究思考疾病的真实世界证候的真实世界上市后再评价治疗的真实世界干预前干预后重大疾病优势病种真实世界汤药安全性有效性松龄血脉康胶囊治疗原发性高血压

实用性医院登记临床研究

主要目的：1、松龄血脉康胶囊临床实际应用治疗原发性高血压的临床疗效评估。2、评估松龄血脉康胶囊临床实际用于治疗的中医证候和对主要症状的改善程度。3、评估医生选择使用松龄血脉康胶囊的理由。4、评估患者对松龄血脉康胶囊临床疗效的满意度。5、评估松龄血脉康胶囊临床实际合并用药。6、松龄血脉康胶囊临床实际应用安全性评估。7、松龄血脉康胶囊新适应症发现。8、松龄血脉康胶囊临床优势挖掘。9、撰写并不断改进松龄血脉康胶囊临床用药指南。松龄血脉康胶囊治疗原发性高血压

实用性医院登记临床研究次要目的：建立松龄血脉康胶囊临床实际应用医院登记的研究、质控、数据管理和统计分析平台，长期积累临床数据，不断挖掘松龄血脉康胶囊的临床疗效优势，监测安全性数据，为松龄血脉康胶囊的实际临床应用提供可靠数据支持。

总体设计

整体设计采用真实世界研究方法。样本含量研究总病例确定为5000例。

分组

自然分组：对研究对象不进行事先分组或队列划分，也不影响医院在实际医疗情况下的用药，精确记录在真实条件下，应用松龄血脉康胶囊患者的诊断、治疗、疗效和安全性情况。数据调查完成后，根据不同的分析目的，可以将数据自然分成若干组，以便于比较分析。如分析松龄血脉康胶囊治疗合并或不合高脂血症的原发性高血压的疗效差异等。研究人群

西医诊断标准高血压诊断标准：按照2010年中国高血压防治指南执行。中医辨证标准本研究涉及的中医证候诊断，均按照中医行业标准或学会标准执行。病例入选本研究采用药物流行病学（真实世界研究，RWS）临床研究设计方法，凡是应用松龄血脉康胶囊的原发性高血压患者均作为入选对象；一旦病人开始入选，要求必须连续入选服用松龄血脉康胶囊的病人，不能挑选入选对象，也不能漏选入选对象，直至预先设计好的病例数完成。病例排除本研究采用药物流行病学（真实世界研究，RWS）临床研究设计方法，凡是应用松龄血脉康胶囊的原发性高血压患者均作为入选对象，不设排除标准。治疗方案

试验药品试验药品的名称和规格：松龄血脉康胶囊应用成都康弘制药有限公司生产的上市销售药品。治疗方法用药方法：根据松龄血脉康胶囊药品说明书中用药方法或医生临床经验。疗程：8周。合并用药：试验期间所有合并用药均应在合并用药表中详细记录。观察指标

背景资料观测指标人口学资料：性别、年龄、身高、体重等。一般临床资料：病史、病程、治疗史、合并疾病及用药等。安全性观测指标主要是不良事件观察（随时详细记录），这些不良事件除了症状和体征外，还包括实验室或其他方式检查所见的任何异常发现。观察指标

疗效性观测指标主要疗效指标：舒张压变化。（每两周评估一次）（检测方法：血压测量方法：随访当日测量血压前，不服药。患者于上午8:00-10:00到达诊室，安静休息5min后，用标准水银血压仪进行坐位血压测定，至少测量3次，测量间歇为2min，取连续2次舒张压变化小于5mmHg的平均值。）次要疗效指标：1、收缩压变化。（每两周评估一次）2、血压疗效（试验后医生评估）3、患者满意度（试验后患者评估）4、血压达标率（试验后评估）5、中医症候疗效（试验后评估）6、临床症状体征变化。（每两周评估一次）7、体重指数。（每两周评估一次）8、血脂（根据临床实际检测填写，不做硬性要求）研究结果（2974例）

辨证分型

合并降压药

总体血压变化

基线时：收缩压155.80±14.74舒张压92.41±11.95治疗8周后：收缩压134.17±10.87舒张压81.07±8.42

合并或不合并降压药组舒张压变化合并或不合并降压药组舒张压变化合并或不合并降压药组收缩压变化合并或不合并降压药组收缩压变化血压达标率血压达标率临床症状中医证候疗效

患者满意度

安全性不良事件名称例数百分率注释总数140.47%胃脘胀满20.067%可能有关性功能下降50.17%合并降压药可能无关腹泻20.067%可能有关心悸20.067%可能有关头痛10.034%记录不详低血糖10.034%无关恶心10.034%可能有关

ChinesePharmacopoeia1994199820002010NationalessentialdrugslistNationalessentialdrugslistClassAMarkedNationalessentialdrugslistClassA2009SonglingxuemaikangCapsule(SLXMK)FreshpineneedlesMaincomponentsKudzurootPearl试验名称：松龄血脉康胶囊与氯沙坦钾片对照治疗原发性高血压（1级）随机、双盲双模拟、多中心临床试验试验设计：随机、双盲双模拟、多中心、平行对照试验受试人群：符合原发性高血压（1级）诊断的18-65岁病人样本含量：共计640例。分2组，试验组：阳性对照组=320:320试验药物：试验药物：松龄血脉康胶囊；对照药物：氯沙坦钾片试验疗程：导入期2周，用药8周主要疗效指标：第8周坐位舒张压（SeDBP）与基线相比平均变化正在进行的研究丹红注射液医院注册登记研究（脑梗死）主要目的：丹红注射液临床实际应用治疗脑梗死的院内结局（NIHSS）丹红注射液临床实际应用治疗脑梗死发病3-6个月结局（死亡率、复发率、改良Rankin）丹红注射液临床实际应用安全性评估。丹红注射液医院注册登记研究次要目的：评估丹红注射液临床实际应用过程中不同人群和亚组的临床疗效特征。评评估医生选择使用丹红注射液的理由。评估患者对丹红注射液临床疗效的满意度。评估丹红注射液临床实际合并用药并评估相互作用。丹红注射液临床优势挖掘（包括用药时机、疾病特征等）。撰写并不断改进丹红注射液临床用药指南。建立丹红注射液临床实际应用医院登记的研究、质控、数据管理和统计分析平台，长期积累临床数据，不断挖掘丹红注射液的临床疗效优势，监测安全性数据，为丹红注射液的实际临床应用提供可靠数据支持。

总体设计

整体设计采用CER临床登记（真实世界研究，RWS）临床研究设计方法。样本含量首次研究总病例确定为3000例，脑梗死1500例。

分组

自然分组：对研究对象不进行事先分组或队列划分，也不影响医院在实际医疗情况下的用药，精确记录在真实条件下，应用丹红注射液患者的诊断、治疗、疗效和安全性情况。数据调查完成后，根据不同的分析目的，可以将数据自然分成若干组，以便于比较分析。如分析丹红注射液在中风病急性期超早期应用（6小时之内）与非超早期应用的疗效差异等。

研究人群

西医诊断标准脑梗死诊断标准：参照中华医学会神经病学分会发布的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》执行。中医辨证标准本研究涉及的中医证候诊断，均按照中医行业标准或学会标准执行。病例入选符合脑梗塞（急性期或恢复期）或冠心病心绞痛诊断；符合丹红注射液适应症并使用者；一旦病人开始入选，要求必须连续入选服用丹红注射液的病人，不能挑选入选对象，也不能漏选入选对象，直至预先设计好的病例数完成。病例排除超说明书用药者治疗方案

试验药品丹红注射液应用菏泽步长制药有限公司生产的上市销售药品。

治疗方法用药方法：根据丹红注射液药品说明书中用药方法。

随访：冠心病每月随访一次（包括用药时间），随访至3个月；脑梗塞随访发病3个月和6个月。

合并用药：试验期间所有合并用药均应在合并用药表中详细记录，随访期不再记录合并用药。

观察指标

背景资料观测指标人口学资料：性别、年龄、身高、体重等。一般临床资料：病史、病程、治疗史、合并疾病及用药等。安全性观测指标主不良反应发生率。主要是不良事件观察（随时详细记录），这些不良事件除了症状和体征外，还包括实验室或其他方式检查所见的任何异常发现。

观察指标

疗效性观测指标主要疗效指标：丹红注射液临床实际应用治疗脑梗死的14天结局（NIHSS）丹红注射液临床实际应用治疗脑梗死发病3-6个月结局（死亡率、复发率、致残率）次要疗效指标：总死亡率中医症候疗效临床症状体征变化。患者满意度急性期与恢复期的比较用药结束时NIHSS总分与基线差值(后-前)分析

组别例数均数±标准差最小值最大值中位数统计量P急性期560-2.21±3.04-22.007.00-1.003.8980.000恢复期85-1.12±2.31-10.005.000.00用药结束时Barthel指数与基线差值(后-前)分析

组别例数均数±标准差最小值最大值中位数统计量P急性期55912.47±18.69-100.0090.0054.9900.000恢复期855.47±10.68-35.0045.000.00用药结束时主要症状体征消失率分析

组别半身不遂肢体麻木总例数消失消失率%总例数消失消失率%急性期31410734.123013257.4恢复期261922.6291448.3组别头晕目眩头痛总例数消失消失率%总例数消失消失率%急性期34230288.314312688.1恢复期494081.6211990.5用药结束时脑血管事件发生率分析

组别总例数发生脑血管事件例数未发生脑血管事件例数脑血管事件发生率%统计量P急性期55675491.3--0.602恢复期860860研用药结束时死亡事件发生率分析

组别总例数死亡件例数无死亡事件例数死亡事件发生率%统计量P急性期54525430.4--1.000恢复期860860中医证候疗效分析及组间比较

分组例数临床控制显效有效无效临床控制率%总显效率%总有效率%急性期774234915.235.198.7恢复期371142112.740.597.3患者满意度分析

组别例数非常满意满意不满意非常满意率%总满意率%急性期441169263938.398.0恢复期782352329.596.2不同剂量丹红注射液治疗缺血性脑卒中比较研究（1292）

从2012年9月至2014年3月，我们在中国21家医院，开展丹红注射液医院注册登记研究，共注册登记使用丹红注射液的缺血性脑卒中患者1292例。本研究的入选标准为，经头颅MRI或CT确诊并有责任病灶的缺血性脑卒中患者；使用丹红注射液治疗的患者。排除标准为超说明书使用丹红注射液的患者。按照丹红注射液不同使用剂量，采用配对的方法，分成20ml和40ml两个剂量组不同剂量丹红注射液治疗缺血性脑卒中比较研究采用配对对照设计方法。按照以下原则进行配对筛选，缺血性脑卒中急性期（发病2周以内）、前循环脑梗死、同性别，年龄±5岁，NIHSS评分±1分。1292注册登记缺血性脑卒中患者1024急性期492部分前循环脑卒中268被排除

268发病超过两周532被排除164例后循环59例全部前循环脑卒中294例腔隙性脑卒中15例未知206被排除187例用药剂量30ml19例用药剂量其他114用药剂量20ml172用药剂量40ml74入20ml组40被排除

1例年龄39例NIHSS98被排除

2例年龄57例性别39例NIHSS74入20ml组配对条件

同性别年龄±5岁，NIHSS±1Figure1.Screening,Completionof14-DayEvaluations.主要评价指标NIHSSscore和次要评价指标BIscore从基线到治疗后的变化情况

Table2.ChangesinNIHSSscore,BIscore*VariableMeanChangefromBaseline(95%CI)Between-GroupDifference(95%CI)PValue§20mlGroup(n=74)40mlGroup(n=74)20mlGroupvs.40mlGroupNIHSSscore☆-2.65±4.40(-3.67～-1.63)-4.14±3.79(-5.01～-3.26)1.49±4.10(0.15～2.82)0.029BIscore★15.81±23.20(10.44～21.19)20.82±19.38(16.30～25.34)-5.01±21.39(-11.99～1.96)0.158主要评价指标NIHSSscore和次要评价指标BIscore从基线到治疗后的变化情况Figure2.MeanChangesinNIHSSscoreandBIscoreat14Days.Outcomescoresareshownforthe20mlgroup(blue)andthe40mlgroup(red).